mNGS协助诊断肺毛霉菌病一例

【2022年感染性疾病案例展示入围稿件】

作者：宋江勤1 胡福英2 李华顺3 田友军4 周君阳1

单位：湖北省天门市第一人民医院：1.检验科，2.呼吸内科，3.病理科，4.影像科

前言

侵袭性真菌病在临床上相对少见，其起病隐匿、临床症状不典型、病情进展迅速，早期病原学诊断较困难，病死率较高。总状横梗霉菌（Lichtheimiaramosa）是一种隶属于接合菌门、毛霉目、横梗霉属的真菌生物，免疫功能低下者易感[1]，可导致毛霉菌病，其特征为菌丝侵犯血管，引起血栓形成及坏死，可导致鼻、脑、消化道及呼吸道等处病变[2]。毛霉菌目真菌很少感染免疫功能正常的宿主[3]。由于毛霉菌病发病急、进展快，传统检测方法阳性率低，一般抗菌治疗无效，预后差、病死率较高，而通常在患者病死后尸检才明确诊断，因此尽早确定病原菌对于改善预后、降低病死率，具有重要意义。

近年来，宏基因二代测序（mNGS）筛查病原体技术快速发展，mNGS测序通量高、速度快，理论上能检测所有已知病原体，对危重及疑难感染性疾病，可早期、快速、精准鉴定其病原体，为临床治疗提供依据[4-6]。现报道采用mNGS协助诊断毛霉菌病1例，以期为临床诊断和治疗侵袭性真菌病提供借鉴。

案例经过

1、病史与体格检查

患者，男性、51岁，因“间断胸痛、咳嗽5月余”于2020年9月21日于天门市第一人民医院呼吸内科治疗。患者曾于2020年3月26日因“胸痛3d”于本院呼吸内科治疗，查体：咽不红，双侧扁桃体不大，表浅淋巴结不大，双肺呼吸音粗糙，未闻及干湿啰音。结合病史、体格检查、辅助检查临床诊断为“病毒性肺炎，支气管扩张”，予以抗感染（莫西沙星）、抗病毒（阿比多尔）及对症支持治疗，住院12d，胸痛、胸闷、气促以及咳嗽等症状减轻出院。

患者因“胸痛不适伴活动后胸闷气短”，多次入院治疗，疗效欠佳。9月3日通过NGS检测其肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）（表2），结合病史、临床表现、辅助检查结果，确诊为毛霉菌病。患者于2020年9月21日入本院继续治疗。体格检查：患者神志清楚，咽部无充血，双侧扁桃体不大，表浅淋巴结未及肿大，右肺呼吸音稍减弱，未闻及干湿啰音，心界不大、心音可、律齐、无杂音。既往史：伴急性肾功能不全史；无高血压、冠心病、糖尿病、肺结核、肝炎病史；有参麦过敏史。发病以来，食欲减退、精神稍差。

2 . 辅助检查

患者3月21日入院后查血常规，中性粒细胞比率78.5%（正常值：40%～75%），淋巴细胞比率14.70%（正常值：40%～75%）。白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）28.68pg/ml（正常值：＜7pg/ml）；肝肾功能、凝血功能、红细胞沉降率（erythrocyt e sedimentation rate，ESR）、呼吸道病毒（嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、Q热立克次体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒）无明显异常，新型冠状病毒核酸检测阴性。自4月3日起，患者ESR开始升高。8月18日查抗可溶性抗原（extractable nucler antigen，ENA）、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM，补体C3、C4，无明显异常。患者病程中血常规指标变化详见表1。

2020年5月前往上海A医院呼吸内科住院治疗，血液T-Spot：阴性；寄生虫专项检测（10项）均阴性。全身 PET/CT示：右肺炎性病变可能；双肺慢性炎性小结节可能；两肺慢性炎症；右侧胸腔积液；右上肺胸膜下占位穿刺组织病理结果示：见少许横纹肌组织及大片坏死，特殊染色未见阳性菌。肺组织 mNGS：细菌、病毒真菌、寄生虫、分枝杆菌等均阴性。考虑“不明病原体急性感染后坏死 ”可能，予「阿莫西林胶囊0.5tid+多西环素0.1bid」口服1 个月。

2020年9月前往广州B医院呼吸内科住院治疗，病毒：血传播八项：阴性；九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测阴性；细菌：PCT：0.07ng/mL，C反应蛋白4.16mg/dL，细菌涂片阴性，培养阴性，冷凝集试验<1:4；真菌：血液G和GM试验；血液曲霉和隐球菌抗原阴性；烟曲霉（IgE-m3），总IgE测定阴性；结核：痰结核涂片，TB-DNA，X-pert，分枝杆菌菌种鉴定（DNA微阵列芯片法）等均阴性；血 T-spot：抗原A(ESAT-6)孔6 ↑ 个,抗原B(CFP-10)孔9 ↑ 个,阴性对照孔0 个,阳性对照孔>100个。肺肿瘤：肺肿瘤五项阴性；结缔组织病：血沉90mm/h；血清淀粉样蛋白A >200mg/L；风湿三项，抗核抗体普十一项阴性；免疫球蛋白G4 1.37g/L；血管炎性疾病：血管炎五项，抗心磷脂抗体，免疫八项等为阴性；过敏性疾病：总IgE（TIgE），曲霉IgE（m3）均为阴性；其他：肝功八项，血气分析，CX3生化八项，心梗鉴别六项，凝血功能，肾功能等大致正常；细菌涂片二项（抗酸染色+革兰染色）阴性；普通细菌培养阴性；曲霉菌抗原检测:5.6114ug/L（<0.5），隐球菌抗原：阴性；结核T-Spot，TB-DNA，肺结核分枝杆菌（DNA微阵列芯片法）等均阴性。

该患者首次入院胸部X线计算机断层摄影（computed tomography，CT）（图1A）提示双肺感染性病变，双肺见多发斑片状磨玻璃影，边缘模糊，以右下肺病灶较为明显，双侧胸膜增厚黏连。患者出院后反复胸痛不适，4月23日再次入院，复查胸部CT（图1B）提示：双肺见多发斑片状及条片状高密度灶，部分病灶边缘模糊，右肺下叶病灶较前稍增大，右肺上叶前段新增小片状磨玻璃密度灶，左肺下叶病灶体积稍缩小。5月29日复查胸部CT（图1C）提示双肺见多发斑片状及条索状高密度灶，边界不清，邻近胸膜增厚、粘连，右上肺及下肺病灶范围无明显缩小。8月29日复查胸部CT（图1D）提示：双肺内见多发斑片状及条索状高密度灶，双肺下叶部病灶范围稍缩小，右肺上叶及左肺下叶可见新增磨玻璃样及片状实性高密度影，边界欠清晰。10月1日复查胸部CT（图1E）右上肺部分病灶内见空洞形成，双肺下叶部分病灶范围扩大，右侧胸腔积液增多，磨玻璃影未见。10月12日复查胸部CT（图1F）示：较前片（10月1日），大部分病灶范围缩小，右上肺空洞较前稍缩小，右侧胸腔积液基本消失。

图1患者胸部CT：A：3月26日CT示双肺感染性病变。B：4月22日CT示右下肺见斑片状高密度灶，病灶范围较前明显增大。C：5月29日CT示右上肺及下肺病灶范围无明显缩小。D：8月29日CT示右肺上叶及左肺下叶可见新增磨玻璃样及片状实性高密度影。E：10月1日CT示部分病灶内见空洞形成，磨玻璃影未见。F：10月12日CT示大部分病灶范围稍缩小，右上肺空洞较前缩小。

3.病理学

4月24日患者行CT引导下经皮肺活检术，组织活检提示：部分肺泡组织凝固性坏死（见图2）；真菌荧光染色为阴性。

4.肺组织病原学检查

4月24日患者肺组织革兰染色示案例分析：未发现细菌、真菌菌丝及孢子；组织培养（普通细菌、厌氧菌、真菌）示无细菌生长。

5.肺泡灌洗液宏基因二代测序

检出微生物主要为横梗霉属总状横梗霉菌，序列数为260，相对丰度为52.95%；耐药基因未检出，见表2。

患者于2020年9月21日转入本院继续治疗，根据患者病史、临床表现，mNGS以及CT等结果，考虑患者为肺部真菌感染，病原菌为总状横梗霉菌，自2020年9月5日开始使用两性霉素B抗真菌治疗，剂量：30mg/10h，静脉泵入。住院期间多次查血钾偏低，尿素、肌酐增高，行补钾、护肾等对症治疗。10月12日复查胸部CT示大部分病灶范围缩小，右上肺空洞减小（图1F），患者咳嗽、胸闷等症状缓解出院，后转为门诊治疗，期间定期复查胸部CT、血常规及肝肾功能，至2021年6月疗程结束。

案例分析

临床医师

本例患者于2020年3月出现右侧胸痛，运动后疼痛加重，气促明显，无头痛发热，无咳嗽咯痰。时值新型冠状病毒肺炎流行，患者为湖北医务工作者，胸部CT示感染性病变，根据病史、临床表现及CT结果，行抗病毒、抗感染治疗，疗效欠佳。患者后因“胸痛”多次住院，给予多种抗感染治疗方案，病情均无明显改善，并于8月份加重，出现磨玻璃影及胸腔积液，胸痛不适加重，伴活动后胸闷气短。利用mNGS检测其BALF提示总状横梗霉菌感染，临床考虑毛霉菌病，经两性霉素B治疗后，患者双肺病灶减小，胸痛症状减轻，咳嗽完全缓解，疗效明显。两性霉素B可导致药物性低钾以及肾脏损伤，患者住院期间多次查血钾偏低，尿素、肌酐增高，提示应定期监测服用两性霉素B患者的电解质、肾功能指标（尿素和肌酐），注意补钾和保护肾功能。

检验医师

该患者主要特征为肺部阴影伴空洞，伴有胸痛，考虑感染性疾病和非感染性疾病，感染性疾病病原体考虑分枝杆菌、真菌、其他特殊病原体感染、肺外感染累及肺部，支持点有胸痛症状、PCT:0.07ng/ml，C反应蛋白：4.16mg/dl，t-spot阳性，影像学倾向于感染性疾病，肺组织病例提示凝固性坏死，不支持点有无病原学依据，外院抗感染效果不佳。非感染性疾病考虑恶性肿瘤、机化性肺炎、过敏性肺炎、肺栓塞。非感染性疾病支持点有胸痛症状，血沉90mm/L，血清淀粉样蛋白A>200mg/L，影像学肺部阴性伴空洞，不支持点有结缔组织疾病、血管炎、肺肿瘤标志物等均阴性，肺组织病理未见肿瘤细胞，全身PET-CT未见其他部位的肿瘤，本院肺动脉CT造影未见栓塞。

患者考虑感染性疾病的可能性大，但经历两次经皮肺穿活检，组织相关的病原学检查均为阴性，T-SPOT检查为阳性，但其他的涂片、培养及MTB-DNA相关检查均为阴性，再加之多种抗生素抗感染无效，考虑少见病原体的感染，常规培养无法检出。

知识拓展

毛霉目真菌在土壤、粪便、禾草及空气等环境中广泛存在[7]。尸检研究表明，毛霉真菌是侵入性真菌感染中常见的致病菌[8-9]；据统计，2007至2015年，欧洲毛霉菌病发病率不断上升，其中以根霉属最常见[10]。毛霉菌病是一种发病急、进展快、病死率极高的系统性条件致病性真菌感染。免疫功能低下者易感，尤其是患有糖尿病、白血病、免疫功能缺陷性疾病、恶性肿瘤患者；大剂量使用抗菌药物、皮质类固醇激素患者最易感染[11]。该病起初多发于鼻黏膜或鼻窦，继而扩展至眼眶软组织、面腭及脑，也可全身性播散，预后较差。毛霉目真菌感染肺部的病例罕见[12]，本例患者既往体健，无高血压、冠心病、糖尿病、肺结核病史等慢性病史，未大剂量使用抗菌药物、激素，不属毛霉目真菌易感人群，且发病特点及临床表现不典型，因此不能忽视免疫功能正常的人群也能发生毛霉菌病。

案例总结

本例患者在发病初期行组织真菌荧光染色、组织培养、组织革兰染色，结果均为阴性，未能明确病原体。特别是在本院及A医院的肺穿组织培养及mNGS均未检出病原菌，组织病理的荧光染色也未见菌丝，而B医院BALF的mNGS检出致病菌（总状横梗霉菌），给临床医生造成困扰，作为检验人员考虑可能是穿刺组织为坏死组织，其中并不含病原体或者病原体已经死亡裂解，这样会导致穿刺组织好培养阴性或者mNGS阴性。

侵袭性真菌病的诊断通常依赖于真菌培养和活检组织检查，但阳性率较低，毛霉菌病患者易错过最佳治疗时间[13]；尸检有助于明确诊断，但因其滞后性，对临床治疗意义较小[14-15]。G试验是临床检测真菌抗原的常规方法[16]，但毛霉菌不产生抗原物质，故G试验对毛霉菌诊断价值较低。对于侵入性真菌感染的诊断，真菌培养（传统“金标准”）检测周期长，阳性率较低；G试验和GM试验的结果缺乏特异性，灵敏度较差。

相比传统基因检测方法，mNGS检测具有明显技术优势和广泛的临床用途[17-18]。mNGS可一次性产生覆盖基因组特定区域（从数个基因到数百个基因以至全外显子组或全基因组）的高通量测序数据[19]，可同时检测多种细菌、病毒、真菌或寄生虫的DNA/RNA序列，且准确率高[20]。mNGS检测费用较高，但相比传统检测方法，单基因单位点的平均检测费用更低，大部分患者可负担[21]。mNGS灵敏度高于传统临床检验方法[22]。mNGS可为复杂感染的诊断提供直接线索[23]。考虑到毛霉菌病的高病死率，对于不明原因的重症肺炎，可将mNGS作为常规检测[24]。

专家点评

毛霉菌病发病急、进展快、病死率极高，早期诊断和选择敏感抗真菌药物治疗是患者获得良好预后的关键[25]。本例通过mNGS检测确定不明原因肺部感染者的病原体（总状横梗霉菌），并根据mNGS检测报告调整其治疗方案，疗效较好。因侵入性真菌感染诊断困难，对于不明原因肺炎患者（特别是高度怀疑毛霉菌病患者），mNGS应成为常规检测手段。可根据mNGS及其他检查结果，确定感染病原体，选用敏感药物，提高毛霉菌病的治愈率。

总之，mNGS可对侵袭性真菌病做出准确快速的病原学诊断并提供治疗依据。（胡福英 天门市第一人民医院呼吸与危重症医学科副主任医师）

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编辑：笪文武 审校：陈雪礼