专访吉大赖良学丨转基因专家团队率先开发单个AAV递送碱基编辑器

作为一种革命性的基因组编辑平台，CRISPR-Cas9 凭借其高效率、操作简便和低成本的优势，已被广泛应用于生物技术和医学领域。

CRISPR-Cas9 工具包括 SpCas9、SaCas9 两种类型。由于每种系统仅识别特定的原始间隔区相邻基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM），因此单一的编辑工具通常由于缺乏广泛的 PAM 而存在靶向区域的限制。

另一方面，碱基编辑器的体内递送同样存在挑战。当前体内基因编辑最常用、最高效的递送载体是腺相关病毒（AAV）。然而，AAV 的装载能力有限，仅为 4.7kb。在此之前，由于碱基编辑器超过了 AAV 的装载上限，研究人员普遍采用的策略是通过两个单独的 AAV 分别包装碱基编辑器的一部分，然后让其在递送后组装成完整的碱基编辑器。

双 AAV 载体的递送策略存在两个明显不足：一是大大降低了基因编辑效率；二是需要更高的 AAV 剂量。而高剂量 AAV 可能会导致免疫原性和肝毒性。这在一定程度上限制了碱基编辑技术的临床应用和发展。

日前，吉林大学李占军教授团队、赖良学教授团队合作开发了一种名为 Cje3Cas9 的新型紧凑型 Cas9，可用于体内的高效基因编辑和腺嘌呤碱基编辑。研究论文 Compact Cje3Cas9 for Efficient In Vivo Genome Editing and Adenine Base Editing 发表于 The CRISPR Journal 期刊。

（来源：The CRISPR Journal）

该研究的通讯作者之一，来自吉林大学动物医学学院的赖良学教授介绍道：“传统的 SpCas9，尤其是碱基编辑器，应用的最大阻碍之一在于尺寸过大，难以通过单一的 AAV 系统进行有效递送，限制了其临床应用前景。相比之下，紧凑型基因编辑工具，比如小 Cas9 及其碱基编辑器能被单 AAV 包装并有效递送，将有助于进一步推动碱基编辑器的临床应用。”

▲图 | 赖良学（来源：受访者）

赖良学长期专注于基因编辑技术优化、基因编辑大动物模型的建立与应用，基于大动物模型的干细胞及基因治疗等方面的研究工作。他先后在 Science、Cell、Nature Biotechnology 等国际期刊上发表论文 190 余篇，论文被引次数达到 10000 余次，单篇文章被引 1300 余次。同时，他也是国家高技术研究发展计划（863）重点项目主持人，国家重大基础研究发展规划（973）项目首席科学家，中国海外杰出青年基金获得者。

更小的尺寸，更广泛的基因靶向范围

Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）凭借高编辑效率和更广泛的 PAM 识别序列得到了大范围的应用。基于 SpCas9 的碱基编辑器（BE），包括脱氨酶和 Cas9 切口酶，可实现基因组 DNA 中的靶向 C 到 T (CBE) 或 A 到 G (ABE) 转换，是进行治疗应用的强大基因组编辑工具。

然而，SpCas9 长达 1368 个氨基酸的 sgRNA 复合物超过了单个腺相关病毒（AAV）载体的最大容量 (~4.7 kb)，仅凭单个载体无法完成在体内的有效传递。

基于上述问题，探索具有简单 PAM 序列要求、并且体型更小的 CRISPR-Cas 酶是解决困境的关键。在众多小型 Cas9 中，来自空肠弯曲杆菌的 Cje1Cas9 仅有 984 个氨基酸，因此特别适合使用 AAV 进行体内递送。并且，基于 Cje1Cas9 的碱基编辑系统同样具有通过单个 AAV 递送的潜力。然而，Cje1Cas9 需要识别非常复杂的 N3VRYAC PAM 序列，这极大地限制了其靶向基因组的范围。

基于此前的文献报道，研究团队注意到同属于 Type II-C 型的 Nme1Cas9 和 Nme2Cas 具有不同的 PAM 识别序列，即 N4GATT 和 N4CC。他们由此展开设想：在 CjeCas9 的天然同源物中，是否也存在类似具有更简单 PAM 的变体？

因此在最新研究中，研究团队进一步探索筛查确定了两个 CjeCas9 的直系同源物，分别是 Cje2Cas9 和 Cje3Cas9，它们的 PAM 序列不同于 Cje1Cas9 的 N3VRYAC，而是更为简单的 N4CYA，这将有助于扩大对于基因组的靶向范围。

“在 CjeCas9 系列基因编辑工具的筛选和构建工作中，主要挑战在于筛选并鉴定出 PAM 组成简单、同时效率较高的新型 CjeCas9 同源物。”赖良学对此介绍道。

基于 NmeCas9 和 CjeCas9 的结构，研究人员比对了 NCBI IPG 数据库中的 1600 余种 CjeCas9 同源物，发现其中有 96 种都存在关键的 T913D 氨基酸变体。他们推测，这个改变极有可能会引起 CjeCas9 的 PAM 向 N4C 类转变。

▲图丨Cje2/3Cas9 的详细 PAM 序列分析（来源：The CRISPR Journal）

“于是我们选择了其中 2 个同源物，一个与 Cje1Cas9 有 96% 序列同源性，命名为 Cje2Cas9，一个与 Cje1Cas9 只有60%序列同源性，命名为 Cje3Cas9。经过后续的 PAM 鉴定发现，Cje3Cas9 能够识别更为简单的 N4CYA (Y=C/T) PAM，于是针对其开展优化和开发工作。”赖良学为我们解释道。

Cje3Cas9 不仅在尺寸上小于现有的小型化 Cas9，例如 SaCas9（1053 aa），NmeCas9（1082 aa），St1Cas9（1121 aa），SauriCas9（1061 aa）和 SpaCas9（1130 aa）等。基于更加简单的 N4CYA 识别区，Cje3Cas9 可靶向的基因组范围显著提升，或将适用于更多遗传疾病的基因治疗。

研究团队的实验数据表明，Cje3Cas9 在细胞中的编辑效率最高达 34%；AAV 递送的 Cje3Cas9 和 Cje3-ABE 系统在小鼠肝脏中分别实现了16.4% 和 12.1% 的编辑效率，并且没有观察到明显的脱靶编辑和肝脏毒性。

▲图丨由 Cje3Cas9 介导的体内基因组编辑通过一体式 AAV 递送（来源：The CRISPR Journal）

基于当前的研究发现，赖良学表示，“Cje3Cas9 及其碱基编辑器有望用于遗传疾病的基因治疗，但在不同基因位点的编辑效率差异性大，如果 Cje3Cas9 工具走向临床应用，其效率仍需进一步提高，安全性也需要进一步详细评估。”

据其透露，该研究的下一步计划将在于继续设计优化 Cje3Cas9 以提高其编辑效率，并希望能进一步简化其 PAM，从而增强其应用潜力。

让先进的基因编辑“工具”进入农业、畜牧业及医学等广阔领域

俗话说“工欲善其事，必先利其器”。近年以来，赖良学及其团队同时致力于研究基因编辑的“工具”，深入挖掘基因编辑技术的优化工作。今年 4 月，他与五邑大学副教授邹庆剑团队合作，首次将腺苷脱氨酶与转录激活因子样效应子（TALE）融合，开发了一种不会产生 Cas9 依赖性脱靶的新型碱基编辑系统 TaC9-ABE ，相关发表于 Nature 子刊 Cell Discovery。

▲图丨TaC9-ABE 工程具有高靶向活性且没有可检测到的 Cas9 依赖性脱靶（来源：Cell Discovery）

5 月，其建立的一种同时兼具当前多种单碱基编辑器及 CRISPR-Cas9 基因编辑功能的多功能碱基编辑器 AGBE 登刊 Nucleic Acids Research，该工具能够利用单个向导 RNA（sgRNA）诱导同一等位基因的靶序列单独或同时发生包括 A-to-G、C-to-G、C-to-T 和 C-to-A 等 4 种不同类型的碱基转换。

“在我看来，基因编辑疗法开发的核心要点是开发更有效、更安全、适用于更多的疾病谱，以及更容易被递送至靶向组织和细胞的编辑器，从而能够直接用于治疗遗传等疾病。”赖良学教授介绍道，“接下来，我们团队还将继续对基因编辑技术进行优化，以提高其有效性、安全性和扩展其对疾病治疗的使用范围。

赖良学教授不仅仅是基因编辑技术优化领域的专家，其还长期深耕于基因编辑大动物模型与应用、基于大动物模型的干细胞及基因治疗等领域，并取得众多技术成果。

早在 2011 年，赖良学首次利用锌指核酸酶基因打靶技术敲除了猪内源性 PPARγ 基因，该类基因敲除猪模型对于糖尿病和心血管并发症的研究具有重要应用价值。不仅如此，科学界普遍评价其“基因敲除克隆猪的出现也是向异种器官移植迈出的关键一步”。

（来源：Cell Research）

此后，赖良学教授于动物克隆、转基因和基因打靶技术领域中多次取得业内领先的突破性进展。在此基础之上，成功地建立了 70 余种在生物医药和农业领域具有重要价值的转基因和基因打靶克隆猪，其中包括 2018 年培育的全球首个“亨廷顿舞蹈病”基因敲入猪，并进行了其干细胞治疗和基因治疗工作，相关成果发表在 Cell 杂志。赖良学教授介绍道：“我们也将在重大疾病大动物模型和基因修饰异种器官移植供体猪模型的培育等方向继续开展相关工作，包括基于大动物模型的干细胞治疗、基因治疗和新药开发，以及异种器官移植的临床前研究。”

不可忽视的是，基因编辑技术在农业、畜牧业及医学领域均具有广阔的应用空间。在技术的持续拓展与延伸下，其将在各个领域中创造出高社会价值与经济价值。如使用基因编辑技术改良动植物品种，从而获得高产、优质、安全的食品；在疾病防治与精准医疗领域，该技术有望为近 6000 种尚无有效治疗方法的人类疾病带来希望，相关基因疗法的临床前研究正在蓬勃开展，包括眼疾、肿瘤和艾滋病等适应症研究则已步入临床，有望在未来惠及多种类疾病患者