nature重磅！东亚“年轻人”更容易发生新冠重症

　　传送器之太长不看版本：《自然》发布：日本科学家发现东亚“年轻人”更容易发生新冠重症

　　传送器之nature原文版本：https://www.nature.com/articles/s41586-022-05163-5#Sec4

　　摘要

　　在宿主遗传学中，识别当下重症的COVID-19的潜在因素是一个新的问题1-5。我们进行了一项全基因组关联研究（GWAS），涉及了在新冠疫情大流行的初期中收集的2,393个日本COVID-19病例和3,289个对照对象，发现了在DOCK2基因附近的 5q35 (rs60200309-A)上发生的一个变异，与“年轻患者（<65岁）”患重症COVID-19的原因有关。（nCase=440，让步比=2.01，P=1.2×10-8）。

　　这种风险等位基因在东亚人中普遍存在，但在欧洲人中罕见，显示出了非欧洲人的GWAS（全基因组关联研究）的价值。对473个大体积外周血的RNA-seq检测发现，风险等位基因对年轻患者的DOCK2基因表达有递减作用。DOCK2的表达在重症COVID-19形式中被抑制。单细胞RNA-seq分析（n=61）确定了DOCK2的细胞类型特异性下调和COVID-19风险等位基因对非经典单核细胞中DOCK2的特异性递减效应。重症COVID-19肺炎的肺部标本的免疫组化显示出DOCK2受到了抑制。此外，在叙利亚仓鼠SARS-CoV-2感染模型中，使用CPYPP抑制DOCK2功能会诱发更严重的肺炎，其特征是体重减轻、肺部水肿、病毒量增加、巨噬细胞募集受损和I型干扰素反应失调。DOCK2在宿主对SARS-CoV-2感染的免疫反应和重症COVID-19的发展中起着关键作用，可以作为一个潜在的生物标志物和/或治疗目标进一步探索。

　　简介

　　由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)引发的COVID-19是一个严重的全球公共卫生问题。尽管最近出现了有发展希望的疫苗，但SARS-CoV-2变种的出现可能会推迟这个大流行病的结束。COVID-19的临床表现多种多样，从无症状感染到致命的呼吸道/多器官衰竭，与多种风险因素有关。

　　人类的遗传背景影响着人们对传染病的易感性或严重性，也可能对二者均产生了影响。Severe Covid-19全基因组关联研究（GWAS）小组报告了3p21上的LZTFL1变异与欧洲人患重症COVID-19的风险有关。令人感兴趣的是，这些变异显示出全球异质性的等位基因频率谱，并且这些变异在东亚人中很少出现。

　　进一步的所做的GWAS工作，包括COVID-19人类基因组计划（HGI），已经指定了宿主易感基因。然而，现有的研究绝大部分是在欧洲人群中进行的。考虑到COVID-19严重程度的全球多样性，对非欧洲人的COVID-19宿主遗传分析也应提供新的见解。

　　日本COVID-19特别工作组（JCTF）成立于2020年初，是一个全国性范围的多中心联盟，来克服日本的COVID-19大流行（扩展数据图1，补充表1）。在此，我们报告了日本人COVID-19的大规模GWAS结果，并与欧洲人进行了系统的比较，确定了DOCK2区域的特定人群风险等位基因赋予了患重症COVID-19的风险，特别是在年轻病例中。

　　我们进一步对COVID-19患者进行了大量的和单细胞的转录组学、免疫组织化学检测，并在模型生物体内进行体内扰动。我们的研究发现，在叙利亚仓鼠的SARS-CoV-2感染模型中，DOCK2的抑制与重症COVID-19的发展有关，而且DOCK2介导的信号传导在宿主对SARS-CoV-2感染的免疫反应中起着关键作用。

　　结果

　　研究参与人员概述

　　在本次的重症新型冠状肺炎病毒的全基因组关联研究（ TheSevere Covid-19 genome-wide association study（GWAS））中，我们从参加日本新冠肺炎特别工作小组（TheJapan COVID-19 Task Force (JCTF)）的100多家医院中，招募了互不相关的2,393名感染新冠病毒的患者。他们是2020年4月到2021年1月（日本的第1次至第3次新冠大流行）中的住院病例。所有病例的新冠确诊均由各附属医院的医生根据临床表现和阳性的PCR检测结果来确认。同时，我们在新冠疫情大流行之前招募了互不相关的3,289名被试作为对照组，由他们来代表常规的日本人口。通过主成分分析法，所有参与者都被确认为东亚血统（详细数据见图2a,b）。

　　在2,393个新冠病例中，有990个病例最终表现出感染新冠的严重症状。我们把出现严重症状的标准定义为病人需要供氧支持、人工呼吸和/或住重症监护室。据此，有1,391个病例表现为新冠感染的轻症。其余12个病例的严重程度信息不明。

　　正如上述报告，与轻症病例（分别为49.3±19.2岁和57.2%的男性）相比，新冠重症患者的年龄相对较大（65.3±13.9岁[平均值±SD]），且男性比例较高（73.9%）。

　　为了进行基因复制研究，我们还从2021年2月至2021年9月（日本第四次至第五次新冠大流行）中招募了1,243新冠重症病例和3,769名对照组。

　　日本人口中的新型冠状病毒的全基因组关联研究(GWAS）

　　包含所有COVID-19病例的全基因组关联研究（GWAS）没有产生满足全基因组的显著阈值的信号（P<5.0×10-8；详细数据见图2c）。

　　跨人群比较证实了以前研究中发现的多个COVID-19相关变异的风险。

　　在我们的日本的研究参与者中，11个显示与新冠阳性有关联的基因座中有7个被复制，P<0.05，包括LZTFL1、FOXP4、TMEM65、ABO、TAC4、DPP9和IFNAR2等。(图1a）

　　在上述七个基因座中，有六个基因座在与重症年轻的COVID-19病例a的比较中观察到最高的ORs。在FOXP4上观察到了最显著的复制，正如预期的那样，该基因座在东亚人中的等位基因频率高于欧洲人（OR=1.29，95%置信区间[95%CI]=1.13-1.46，P=9.1×10-5的严重COVID-19）。相比之下，在欧洲人中表现出最强关联的LZTFL1（rs35081325）的风险等位基因，在日本人中是罕见的。尽管其频率罕见（在对照组中=0.0013），但我们名义上复制了与重症年轻COVID-19病例中最高风险的关联（OR=11.8，95%CI=1.64-85.5，P=0.014）。

　　我们通过硅HLA变异归因分析评估了HLA变异对COVID-19风险的影响。我们没有观察到符合HLA范围内意义阈值的关联信号（P<0.05/2,482个变异=2.0×10-5；详细数据见图3）。在四大ABO血型中，O型血与保护作用有关（P<0.05），在重症和年轻的病例中最为明显（OR=0.73，95%CI=0.56-0.93，P=0.014；详见数据图4a）1。我们发现AB血型的患病风险增加，特别是在重症病例中（OR=1.41,95%CI=1.10-1.81，所有年龄段的P=0.0065）。日本人是拥有AB型血频率最高的人群（在我们的研究中=9.5%），这可能提供了预测风险的能力。

　　跨种群的孟德尔随机化

　　接下来，为了阐明能够影响COVID-19易感性的医疗条件，我们在日本人群中应用了跨人群的双样本孟德尔随机化（MR）分析。 重症COVID-19被推断出与肥胖存在因果效应 (P<0.0074；扩展数据图4b）。我们观察到哮喘、尿酸（UA）和痛风存在的因果推断，而系统性红斑狼疮（SLE）则显示出保护作用（P<0.05）。在日本，高尿酸血症是重症COVID-19的风险因素，这与我们的MR发现一致。在欧洲人中，我们观察到肥胖的显著因果推论（P<6.2×10-6），与自我报告的COVID-19相比，住院和重症COVID-19的效应大小翻倍。我们的分析提供了肥胖作为风险因素的额外证据。

　　DOCK2的特定人群风险等位基因

　　根据观察，许多COVID-19风险变异在重症和年轻病例中赋予更大的影响，我们接下来根据患者的年龄和严重程度对受试者进行分层分析，其中重症COVID-19病例（nCase=990），年轻病例（年龄<65，nCase=1,484），以及它们的组合（nCase=440）被进行分析。

　　当比较年轻的重症COVID-19病例与各自的对照组相比，我们在5q35上发现了一个满足全基因组意义的基因座（rs60200309的P=1.2×10-8；图1b）。位于DOCK2下游基因间区域的主导SNP（rs60200309）的A等位基因与严重COVID-19感染的风险膨胀有关（OR=2.01，95%CI=1.58-2.55，P=1.2×10-8；图1c）。在包括所有COVID-19病例和对照组的其他比较中，风险rs60200309-A等位基因也与COVID-19的风险升高有关（OR=1.24，也表现为病例内严重程度分析（即重症与非重症病例；所有年龄的OR=1.27，年龄<65的OR=1.90）。

　　然后，我们利用在日本的后几波大流行中另外收集的1243个重症病例和3,769个对照组进行了复制研究。 我们在年轻病例中复制了一个特定年龄的名义风险（nCase=833；OR=1.28，95%CI=1.02-1.61，P=0.033）与所有年龄段（OR=1.00，95%CI=0.85-1.19，P=0.96）相比，而效果规格小于在最初大流行波中收集的GWAS病例中观察到的。我们注意到，在后面的大流行浪潮中，普遍观察到其他风险位点的严重性风险下降（例如，LZTFL1的OR从11.8降至4.4；回归系数=0.57；扩展数据图5）。这可能表明，伴随着大流行浪潮的混杂因素的纵向转移，如治疗策略的引入、疫苗接种的高普及率、住院政策的变化和病毒株的演变，可能减轻了最初大流行浪潮中定义的宿主遗传学负担，而进一步的评估将是有必要的。

　　我们还研究了不同血统的DOCK2变异的COVID-19风险（3,138医院病例与来自泛血统荟萃分析产生的891,375对照组）我们注意到具有边缘关联信号的相同方向效应。该变异在东亚人中很普遍（=0.097），在日本人中频率最高（=0.125），在美国本地人中频率较低（=0.049），但在其他血统中非常罕见。（<0.005；图1d）。在日本人22中进行的自然选择筛查表明该变异的边际正选（PSDS=0.051）。DOCK2变异的人群特异性特征为在非欧洲人中进行COVID-19宿主遗传学研究提供了依据。

　　DOCK2在重症COVID-19病例中抑制

　　为了对DOCK2风险变异进行功能注释，我们通过对JTCF(n=473)收集的covid-19患者进行外周血RNA-seq检测来检测eQTL效应。DOCK2的风险等位基因（rs60200309-A）对所有患者都没有显示出明显的eQTL效应（β=- 1.07，P=0.083；图2a）。当按年龄分层时，在年轻患者中观察到了风险等位基因对DOCK2显现水平的负面影响（n=270；β=-2.15，P=0.0030，年龄<65）。该等位基因在其他周围的基因上没有显示任何明显的eQTL（±500kb窗口，P>0.070）。我们也观察到了GWAS和DOCK2 eQTL信号之间的同位性（同位性后验概率>0.01；扩展数据图6）。

　　我们在重症和536例非重症covid-19患者之间，进行了对DOCK2的基于实时qpcr的DE分析 (n=468)。我们发现在重症患者中DOCK2的表达减少 (=DOCK2/GAPDH）（P=0.011；图2b）。当分组为年轻患者时，对DOCK2的抑制更为明显（P=0.0068）。当患者进一步分组为无症状、轻度、重症和危重病例时，我们观察到DOCK2的表达水平与严重程度等级之间呈负相关（图2c）。同时，DOCK2表达在重症COVID-19患者的外周血细胞中抑制，特别是在年轻患者中，风险变异可能通过抑制DOCK2的表达导致重症COVID-19。

　　DOCK2（dedicator of cytokinesis 2）是一种Rac激活剂，参与趋化因子信号、I型干扰素（IFN）产生和淋巴细胞迁移。要弄清DOCK2在COVID-19生物学中的作用，就必须弄清免疫细胞类型的特定表达谱。因此，我们对来自30个COVID-19重症病例和31个健康对照的外周血单核细胞（PBMC）进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。我们获得了394,526个高质量的单细胞，并注释了12个集群（图2d和扩展数据图7）。投射时，DOCK2在CD16+单核细胞中的表达最高（图2e）。先天性免疫细胞群（单核细胞和树突状细胞[DC]）中表达DOCK2的细胞比例（43.8%）高于其他细胞群（25.6%；图2f）。DE分析也表明，在COVID-19重症病例中，免疫细胞群中的DOCK2表达也受到抑制（单核细胞的FC=0.82，P=8.3×10-4；DC的FC=0.87，P=0.050；图2g）。

　　为了分解免疫细胞类型的特异性，我们重新进行了聚类和注释，提取了63,544个属于先天性细胞群的细胞（图2h和扩展数据图7）。在分类的细胞类型中(经典[CD16+CD14++]，中间体[CD16+CD14+]，和非经典[CD16++CD14+]单型，传统树突状 和浆细胞样树突状细胞)，DOCK2的表达明显较高，这些单核细胞涉入了COVID-19的病理生理学（图2h-j）。DE分析显示DOCK2在非经典单核细胞中的抑制作用最强（FC=0.61，P=3.2×10-7；图2k）。 Covid-19病例的非经典单核细胞中DOCK2共表达基因模块涉及到丰富的途径，如免疫反应信号途径和吞噬作用（扩展数据图7）。为了巩固变异功能的证据，我们评估了DOCK2风险变异的单细胞eQTL效应。我们发现COVID-19风险变异对DOCK2在非经典单核细胞中的表达有特定的剂量递减效应（COVID-19的β=-0.21，P=0.035；对照组的β=0.02，P=0.51；图2l）。

　　然后我们评估了DOCK2抑制的生物学影响。在原生细胞实验中，通过CPYPP（一种DOCK2-Rac1相互作用的抑制剂29）对DOCK2的抑制表明，在CpG刺激下，pDC产生的IFN-α减少（FC=5.5×10-5，P=0.0038，每组n=3；扩展数据图8a）。 pDC是参与COVID-19致病性30的另一个关键先天免疫细胞，在COVID-19病例中DOCK2的表达抑制（FC=0.79，P=0.019；图2k）。在CXCL12刺激下，CD3+T细胞的趋化作用被阻断（FC=0.57，P=1.0×10-7，每组n=19；扩展数据图8b）。DOCK2风险变异与pDC中IFN-α产生和CD3+T细胞趋化的表型联系不显著。在THP-1蓝色ISG细胞中，DOCK2显示了ISG的转录激活明显减少，这是I型IFN的替代物（扩展数据图8c-f）。这些结果突出了DOCK2在COVID-19恶化中的重要免疫作用，如I型IFN免疫和趋化性失调，例如I型IFN免疫先天性受损的患者。

　　为了证实DOCK2参与到了COVID-19肺炎，我们用COVID-19的人类尸体解剖进行了免疫组织化学分析。 (扩展数据图9)。我们检查了3例COVID-19肺炎病例，观察到DOCK2在肺部和肝脏淋巴结的淋巴细胞和巨噬细胞中的表达减少（样本1-3；图2m）。在两个没有肺炎的对照样本中，我们没有观察到这种减少（样本4，5；图2n）。据报道，DOCK2在COVID-19患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞中受到抑制，这与我们的发现一致。我们观察到非COVID-19重症肺炎病例（样本6）的淋巴细胞中DOCK2的表达消失，而非COVID-19轻症肺炎病例（样本7）中DOCK2的表达略有下降。因此，在COVID-19引起的重症肺炎期间，DOCK2的表达会被抑制。这些观察揭示了DOCK2的细胞类型和组织特异性抑制之间的联系，提供了作为严重COVID-19的生物标志物的潜在价值。

　　叙利亚仓鼠模型中的DOCK2抑制作用

　　为了搞清楚DOCK2在COVID-19中的体内发病机制，我们用叙利亚仓鼠模型调查了感染SARS-CoV-2后DOCK2抑制的效果（扩展数据图10a）。对模拟感染的动物施用CPYPP（DOCK2抑制剂）或Vehicle（阴性对照）并没有诱发体重下降（扩展数据图10b）。当使用Vehicle时，感染SARS-CoV-2的动物（n=12）在dpi7时体重下降到83.3%，然后，体重在dpi11时恢复到97.6%。相反，当使用CPYPP时，感染SARS-CoV-2的动物（n=13）在dpi7时体重出现异常下降到79.0%，然后在dpi11时体重恢复仅到85.4%（图3a和扩展数据图10c）。我们在施用CPYPP后的模拟感染动物肺部，观察到高级肺水肿（dpi 11；图3b）。在dpi6时观察到最大的肺部重量（图3c）和最大的肺组织病理学评分变化（图3d和扩展数据图10d-f）。在肺部免疫组织化学中，在施用CPYPP的模拟感染动物的体内，CD68巨噬细胞在肺泡细胞周围的迁移受到了影响（图3d和扩展数据图10e）。

　　另一方面，在施用CPYPP的感染动物或施用CPYPP的未感染动物中，肺部损害是轻微的或根本没有（图3b-d和扩展数据图10d-f）。

　　针对SARS-CoV-2诱导的肺炎的恶化阶段（dpi 3和6），我们检测了不同器官中的SARS-CoV-2病毒载量。在施用CPYPP的动物的鼻拭子（dpi 3和6）、肺（dpi 3）和肠（dpi 6，P<0.05；图3e）中，病毒载量有所增多。肺细胞因子表达谱检测显示，在施用CPYPP的情况下，I型IFN（IFN-α/β）在dpi6时减少，II型IFN（IFN-γ）在dpi3时增加（图3f）。我们还观察到，施用CPYPP诱发了炎症细胞因子（dpi3时为IL-6）和趋化因子（dpi3时为CCL5）水平的升高。IFN反应对COVID-19的致病性所起到的作用一直存在争议31,35,36。通过对DOCK2抑制的观察和干预，我们发现了COVID-19肺炎的病理生理学，即感染部位的巨噬细胞募集能力减弱和IFN反应失调导致的病毒消除能力受损，肺部炎症延长。

　　在这篇论文中，我们采用全基因组关联的分析方法（GWAS），分析了COVID-19在日本的情况，这也是最早针对非欧洲国家进行的大规模COVID-19宿主遗传学研究之一。我们的研究不但证实了在不同人群中，多种遗传变异都与感染COVID-19的风险有关。而且还发现了DOCK2上有针对某种特定人群的风险变异，这一点，在最初大范围感染的年轻重症病例身上尤为明显。

　　跨人群MR分析揭示出一种因果推理，那就是在COVID-19上看到了许多复杂的人类特质，比如肥胖。我们的结果突出了针对特定人群的风险等位基因宿主遗传背景的作用，强调了在非欧洲地区，进行COVID-19宿主遗传学研究的必要性。值得关注的是，常染色体隐性基因DOCK2的缺乏是一种孟德尔病，伴有免疫缺陷和严重的侵袭性肺炎感染(OMIM:#616433)。

　　实验结果应该证实了孟德尔病和常见疾病之间的遗传和临床联系。我们又从后续几波大流行病人中收集数据，进行了重复实验，观察到包括DOCK2和LZTFL1在内的风险变异，对COVID-19重症产生的影响虽然相对小了一些，但还是很明显，这与针对最初大流行病人开展的实验，结果一致。

　　但是，宿主遗传是如何与这些复杂因素互动的，进而通过大流行疾病来影响COVID-19的表型谱，仍然是未知的。在不久的将来，应该授权更多的大规模COVID-19宿主遗传学研究，要涉及不同的血液收集地点和阶段，这有助于指导全球健康战略，防止大流行病的发生。

　　通过GWAS的后续分析，我们表明DOCK2介导的信号对SARS-CoV-2感染的反应中起着关键作用，说明异形的DOCK2等位基因参与了COVID-19的恶化，所以，DOCK2或许可以作为预测重症COVID-19的临床生物标志物。

　　对外围血细胞的大量和单细胞转录组分析发现，在重症的COVID-19患者中，DOCK2风险变异抑制了COVID-19特异性eQTL效应，这在先天免疫细胞包括非经典单核细胞和pDC中最明显，但这一结论可能是互为因果的循环论证。

　　未来，在感染初期，风险变异可能会诱导DOCK2的下降。免疫组织化学分析显示，在感染了COVID-19肺炎的肺部，DOCK2是受到抑制的。在叙利亚仓鼠模型中，SARS-CoV-2感染后，CPYPP对DOCK2的体内抑制导致了重症COVID-19肺炎，突出表现为巨噬细胞的迁移受损和IFN反应失调。

　　我们注意到有一种可能性是CPYPP并非对DOCK2有特异性，而是抑制其他的DOCK家族基因。或者，需要对DOCK2进行加强实验，理想情况下，就能为DOCK2在COVID-19中的病理生理学作用提供证据。如果结合其在免疫调节中的关键作用，DOCK2的上调可能被看作是COVID-19的治疗策略。我们的结果促使未来更多的研究，那就是把DOCK2与COVID-19分子和临床表型联系起来帮助我们克服这一大流行病的挑战。