CTCF边界区域生物学功能探究

撰文 | 我的闺蜜老红帽

复杂生物的发育依赖于多种基因表达模式，而这些模式通常是通过远端调节子与基因之间的相互作用来实现的【1】。高通量构象捕获技术（High-throughput conformation capture methods，简称Hi-C）显示【2,3】，真核生物的基因组通常以拓扑结构关联域（topologically associating domains，简称TADs）的形式存在【4,5】，也就是调节子与靶基因之间存在一定距离【6,7】。另外，TADs之间通过边界区域隔开，这就限制了临界域之间调控混乱的情况发生。

转录抑制子CCCTC-结合因子（简称CTCF）存在于大部分边界区域之中【4】，其缺失会导致全基因组缺失TADs【8-10】。在TAD边界区域，CTCF结合位点（CTCF binding site，简称CBSs）在脊椎动物进化中高度保守。染色质环的形成通常与TAD边界密切相关，且常常形成于CBSs对之间。这一偏好性可以用“环挤出模型（loop extrusion model）”来解释。

虽然TAD边界区域在维持染色体空间结构上具有至关重要的作用，它们对基因表达对影响情况仍就不深清楚。在一些特殊位点上突变TAD边界区域通常会产生一定的表型变化，而在其它基因组区域则往往只会导致轻微的转录水平变化。另外，对体外培养细胞的TADs进行广泛突变后，其对基因表达的影响却是很有限的。不仅如此，单个细胞的染色体构象往往于RNA测序所检测到的边界区域变化关系不大。上述存在矛盾的结果显示了在细胞发育阶段，全面系统的研究边界区域十分必要。

2022年7月11日，来自德国柏林的Darío G. Lupiáñez研究组在Nature Genetics上发表题为In vivo dissection of a clustered-CTCF domain boundary reveals developmental principles of regulatory insulation的文章，结合全基因组学分析和小鼠体内试验，揭示了TAD边界区域的具体生物学功能。

首先，作者通过对发育中的小鼠四肢进行CTCF ChIP-seq，确定在Epha4-Pax3（简称EP）边界区域存在6组CBSs。并且，由CBSs所编码和调控的EP元件具有绝缘性能。边界区域往往主要由CBSs构成，这也提示了此位点数目很可能与其功能相关。作者确定，CBS的数目的确可以影响其绝缘性，但每一个位点的独特特征是决定边界区域生物学功能之所在。为了研究CBS之间是否存在冗余性，作者构建了单一和多敲除位点的细胞系，并通过Hi-C图谱等方法确定，CBSs之间是存在协同作用的，但是，如果缺失其中一个位点，其它位点可以部分补偿缺失位点的功能，这也说明边界区域存在一定程度的功能冗余作用。

接下来，作者研究CBS的变化是否会影响“环挤出模型”以及其绝缘性能。作者通过转基因鼠模型发现，在全基因组水平，特定CBSs形成染色质环并不依赖于模体（motif）定向，而是很可能依赖于环结构变化。作者还发现，CBSs的序列多样性以及其定向与绝缘性能关系不大。

再下来，作者研究CTCF结合与EP边界功能之间的关系。作者发现在染色体上，增强子与启动子之间距离是决定该基因表达水平的关键性因素。

在人类和小鼠模型中，PAX3的表达异常很可能导致拇指和食指发育不全。因此，作者最后研究边界区域的绝缘性能与趾端发育之间的关系。作者发现，单一位点的缺失，可以导致Pax3表达异常，但指端发育正常。而多个位点突变则导致Epha4和Pax3的TADs发生融合，从而导致食指发育异常，而此时Pax3表达异常的比例更高。也就是说，边缘区域的绝缘性可以调控基因的表达水平以及相应表型的。

综上所述，作者结合了全基因组分析和转基因小鼠模型系统研究CTCF边界区域的生物学功能。CBS多位点敲除显示其功能存在一定程度的冗余性，并且，其绝缘性能可以调控相应基因的表达和表型。

https://doi.org/10.1038/s41588-022-01117-9

制版人：十一

参考文献

1. Long, H. K., Prescott, S. L. & Wysocka, J. Ever-changing landscapes: transcriptional enhancers in development and evolution.Cell167, 1170–1187 (2016).

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3. de Wit, E. & de Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.Genes Dev.26, 11–24 (2012).

4. Dixon, J. R. et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.Nature485, 376–380 (2012).

5. Nora, E. P. et al. Spatial partitioning of the regulatory landscape of the X-inactivation centre.Nature485, 381–385 (2012).

6. Shen, Y. et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome.Nature488, 116–120 (2012).

7. Symmons, O. et al. Functional and topological characteristics of mammalian regulatory domains.Genome Res. 24, 390–400 (2014).

8. Gómez-Marín, C. et al. Evolutionary comparison reveals that diverging CTCF sites are signatures of ancestral topological associating domains borders.Proc. Natl Acad. Sci. USA112, 7542–7547 (2015).

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10. Hnisz, D. et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.Science351, 1454–1458 (2016).

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