GB 4789.4-2016 沙门氏菌检测过程详解及关键控制点分析

沙门氏菌属（Salmonella）是一群寄生在人类和动物肠道中，生化反应和抗原结构相关的革兰氏阴性杆菌。沙门氏菌属细菌的血清型现已达2500多种。根据DNA同源性，分两个种，即肠道沙门氏菌（S.enterica）和邦戈沙门氏菌（S.bongori）。肠道沙门氏菌又分6个亚种，能感染人类的沙门氏菌血清型，约1400多种，主要在第一亚种中，即肠道沙门氏菌肠道亚种（S. enterica subsp. Enterica）。

沙门氏菌属中少数血清型如伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌是人的病原菌，对人类有直接的致病作用，引起肠热症，对非人类宿主不致病。绝大多数血清型宿主范围广泛，家畜、家禽、野生脊椎动物以及冷血动物、软体动物、环形动物、节肢动物（包括苍蝇）等均可带菌，其中部分沙门氏菌是人兽共患病的病原菌，可引起人类食物中毒或败血症。

所以将沙门氏菌检验规定为食品致病性菌种检验中的重要项目，它的检测过程一般包括样品前增菌、选择性增菌、选择性平板分离划线、初步生化鉴定（确定可疑菌）、生化鉴定、血清学鉴定共计6个步骤。

下面我们就开始对整个检测过程进行分析梳理：（GB4789.4-2016）

1. 样品处理及预增菌

无菌操作称取25g（mL）样品，置于盛有225mL缓冲蛋白胨水（BPW）的无菌均质杯、均质袋或合适容器内，根据标准要求进行均质。若样品为液体，即可以均质，也可以震荡混匀。于36℃±1℃培养8h-18h。

前增菌的缓冲蛋白胨水（BPW），为非选择性的增菌培养基，培养过程中缓冲体系能将培养基维持在较高pH，有利于受损细胞的恢复。

蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求;氯化钠可维持均衡的渗透压;磷酸二氢钾和磷酸氢二钠是缓冲剂。

2. 选择性增菌

将培养后BPW摇匀，取1mL转种于10mL 四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB），于42℃±1℃培养18h-24h，同时再取1mL转种于亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC），于36℃±1℃培养18h-24h。

TTB增菌液的配制有两个注意事项，一是碳酸钙是TTB的正常成分，作用是中和吸收有毒性的代谢物质（主要是培养基酸碱度的变化对菌生长的影响）。但是碳酸钙不溶于水，所以TTB有沉淀是正常的，分装时一定摇匀分装。二是四硫磺酸钠是TTB抑制性的核心成分，培养基也以此命名，但成分表中并没有四硫磺酸钠，它是在碘液煌绿加入后，硫代硫酸钠经碘氧化生成的。四硫磺酸钠对大肠菌群有抑制作用，但不稳定，所以碘液和煌绿必须在临用前加入。

SC培养后，若菌生长，培养液会变红，但是变红不意味着沙门氏菌的存在，还需要往下进行。

3. 选择性分离

将培养后的TTB和SC摇匀，用接种环分别划线接种于BS琼脂平板和XLD琼脂平板，或HE琼脂平板，或沙门显色平板，于36℃±1℃分别培养40h-48h或18h-24h，之后观察各个平板上菌落特征。

单菌落的菌落特征最为典型，利于观察，为获得大量单菌落，一般建议采用三区或四区划线，这样分离效果好，更容易出现单菌落。

BS琼脂是沙门氏菌检验中的必用平板，它的优势在于对伤寒沙门氏菌的检出率比传统平板高30-80%不等。同时在沙门显色培养基出现之前，对变形菌的抑制性和特异性均好于同类培养基。所以BS琼脂一直是沙门氏菌选择分离的首选培养基。

BS琼脂上沙门氏菌菌落特征：菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。

XLD琼脂上沙门氏菌菌落特征：菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。

XLD琼脂里添加了木糖，肠道细菌几乎都可以利用木糖，只有志贺不利用。所以志贺是无色的菌落。其中还添加了赖氨酸，沙门氏菌也能利用木糖产酸，这样就不能与其他肠道菌区分开，但是大部分沙门会产赖氨酸脱羧酶，在酸性条件下把赖氨酸脱羧后形成的尸胺是碱性，会中和木糖产的酸，从而使菌落保持无色。再配合硫化氢指示系统，沙门就变成了我们看到的形态。乳糖和蔗糖的存在可以让产生赖氨酸脱羧酶的大肠菌群大量产酸，从而与沙门氏菌区分。

四种常用培养基菌落形态分类如下

不同的厂家的沙门氏显色培养基，由于其培养基上的酶底物和显色基团不同，所以形成的菌落特征就不同，按照厂家的说明书判断。

4. 初步生化

自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于36℃士1 C培养18h~24h,必要时可延长至48h。

注意：三糖铁琼脂要配制为高层斜面，接种针挑取菌落，于高层斜面上划线，再穿刺（穿刺针不要破壁，不要穿透，距底部5mm左右即可）；同时用穿刺过的接种针接种赖氨酸脱羧酶反应管（分为赖氨酸脱羧酶反应管和对照管，两者都有要接种，表面覆盖2-3滴液体石蜡，防止氧化）。

需要根据下表判定菌落的可疑性，来确定是否再进行下一步的生化鉴定。

5. 生化鉴定

确定可疑菌后，需要进行生化鉴定，若一个一个生化管去做，过程十分的繁琐。根据国标“5.4.3”规定，可疑采用生化鉴定试剂盒或全自动生化鉴定系统进行检测。

6. 血清学鉴定

血清学鉴定是十分必须的步骤，可判定沙门氏菌是否被O多价抗原和H多价抗原血清凝集。

采用的血清可以是进口的或者国内生产的，但是国内血清的凝集性能有时不太好，而进口血清又太贵。所以仅是判定O多价和H多价凝集的，用国产的就可以。

（1）以无菌干净的玻片为载体，滴一滴生理盐水，接种管从营养琼脂平面挑取少量菌体，在生理盐水中涂开，缓缓涂，观察凝集情况，排除自凝。

（2）滴一滴O多价血清于玻片上，重复上述步骤，判断凝集情况，一般情况都会凝集的。除非是有Vi抗原存在时（如鼠伤寒沙门氏菌），会阻止O血清凝集，可挑取菌体至1 mL生理盐水中制成菌悬液，于酒精灯煮沸在检查。

（3）滴一滴H多价血清于玻片上，重复上述（1）中步骤，判断凝集情况。若凝集效果不明显，需要用0.6%半固体琼脂平板诱导，带菌落蔓延生长是，挑取边缘部分进行检查。

典型凝集效果见下图：

7. 关键控制点

a、样品处理

尽可能缩短解冻时间，使竟争菌群生长最少，并减小对沙门氏菌的损伤致病菌取样一定要均匀并具有代表性（蛋黄蛋清混匀取样）。

b、培养基及培养方面

（1）没有一种培养基可疑准确无误的筛选出沙门氏菌，必须选择多种选择性培养基同时筛选，只能说显色培养基综合选择性更强。

（2）试剂和培养基的配置一定要严格按照说明书配置，是否需要高压灭菌，添加剂用量及培养基保存条件。

（3）BS培养基是分离沙门氏菌的高效培养基，特别适用于伤寒类的沙门氏菌，不是所有的选择性培养基都能有效分离出伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌，BS是分离伤寒类沙门氏菌的首选培养基。

（4）BS不能高压，不能过热溶解，只能在使用前一天配置，保存在阴暗处，48h后失去选择性，保存不当，颜色变浅标明已经开始减效。

（5）TTB的添加剂必须在棕色瓶储存，不能见光，否则选择性减弱。TTB有碳酸钙沉淀，分装时一定要摇匀，碳酸钙作用是消除和吸收有毒代谢产物。TTB加入添加剂后就不能再加热。

（6)SC种含有亚硒酸氢钠，剧毒物质，使用时候要注意安全，当天使用当天配置。

（7）TSI最好自己配置，制备成高柱斜面，有助于结果判读

（8）从挑选可疑菌落开始，建议每步都同时划线营养琼脂琼脂，确保每个菌落均为纯菌。

c、生化反应

（1）生化反应要用纯菌落进行（从营养琼脂中挑取单个菌落制备成适宜浓度的菌悬液）。

（2）多种生化试验同时测试可以提高检测效率。

文章来源食品微生物检测。

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