《食品科学》：黑龙江八一农垦大学牛广财教授等：高通量测序分析沙棘酵素自然发酵过程中细菌多样性

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）素有“长寿果”、“神果”和“圣果”之美誉，也是珍贵的药食同源植物，收录于《中国药典》。沙棘果实含有黄酮类、多酚类、多糖类、维生素类、不饱和脂肪酸、氨基酸、5-羟色胺等多种营养成分和生物活性物质，广泛应用于食品和保健品等领域，具有增强人体免疫力，抗疲劳、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、预防心脑血管疾病等多种生理功能。

研究自然发酵食用酵素中微生物菌群的变化规律，是筛选酵素优良与优势菌种的基础。截至目前，鲜见有关沙棘酵素自然发酵过程中微生物群落结构多样性方面研究报道。黑龙江八一农垦大学食品学院的张 琪、牛广财*等基于高通量测序技术，对不同发酵阶段的沙棘酵素中细菌种群组成及多样性进行研究，以期开发和应用酵素优良菌种，为沙棘酵素的可控发酵、安全高效生产和品质提升提供理论依据。

1、沙棘酵素发酵过程中主要理化指标的变化

由图1可知，还原糖质量分数由初始值21.1%呈现持续下降趋势，至发酵后期还原糖质量分数降为10.3%；乙醇体积分数的变化正好与之相反，在发酵前期增长较快，在624 h之后保持稳定，在1 584 h达到4.24%；还原糖含量下降速度比较均匀，说明在发酵过程中，发酵液中的微生物能够充分利用糖类物质，消耗糖类而产生乙醇或者其他物质；pH值在整个发酵中呈先上升后下降的趋势，这可能与一些微生物将有机酸作为替代碳源被部分消耗有关。

2、琼脂凝胶电泳鉴定

沙棘酵素自然发酵过程中不同发酵阶段的发酵液中细菌16S rRNA PCR扩增产物琼脂凝胶电泳结果如图2所示，沙棘酵素自然发酵共分为3个阶段（F22_Q、F22_Z、F22_H）9个样本的PCR扩增产物条带在500 bp左右，与设计引物扩增长度接近，特异性和亮度均较好，可满足下一步的测序要求。

3、高通量测序结果分析

测序样本数据分析

沙棘酵素自然发酵过程中的3个不同发酵阶段样品，经测序后对数据进行分析，根据序列扩增区域338F_806R，可得到原始序列信息，经优化后得到的序列信息如表1所示。通过Illumina MiSeq高通量测序平台整理原始数据，并进行统计优化，沙棘酵素自然发酵样品优化序列范围为38 917～70 982 条，平均长度范围为403.10～418.10 bp，与设计引物扩增长度接近。由于平行样本之间存在误差，但是误差较小，在允许误差范围内，所以数据样本具有有效性，质控合格。

测序样本结果分析

图3、4为沙棘酵素自然发酵过程中不同发酵阶段细菌的稀释曲线图。如图3所示，在测序深度小于20 000时，随着序列数不断增加，Sobs指数显著增加，但是当序列数介于20 000～40 000时，Sobs指数缓慢增加，最终曲线趋向平坦，说明测序数据量合理。如图4所示，在测序数据量0～40 000范围内，Shannon指数曲线趋向平坦，说明测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物多样性信息。

α多样性分析

由表2可知，细菌中覆盖率均不小于99.97%，菌落的覆盖率很高，说明本次测序的样品数据能够覆盖当前沙棘酵素发酵液中细菌的种类，完全能够代表样本中细菌的真实情况。在整个发酵阶段，Shannon指数呈现逐渐升高的趋势，而Simpson指数变化趋势正好与其相反，说明随着发酵的进行，群落的细菌多样性逐渐丰富，在发酵后期达到最高；ACE指数和Chao指数反映的是群落的丰富度，这两个指数也是逐渐增加，说明随着发酵的进行，沙棘酵素酵液中物种的种类逐渐增多。

细菌OTU分布

由图5可知，前期（F22_Q）、中期（F22_Z）和后期（F22_H）含有OTU数分别为99、280、325，其中特有的OTU数分别为8、85、124。由此可见，随着沙棘酵素自然发酵的进行，OTU数呈现显著增加的趋势，说明细菌菌群的丰富度和多样性在逐渐提高，这与多样性指数的分析结果一致，说明沙棘酵素在其自然发酵的整个过程中细菌群落变化较大。

基于门水平细菌群落结构差异性分析

由图6可知，Cyanobacteria是沙棘酵素整个发酵过程中的第一大绝对优势菌门，占据主导作用，是沙棘酵素前期（F22_Q）、中期（F22_Z）和后期（F22_H）3个不同发酵阶段的绝对优势菌门，其相对丰度分别为93.28%、66.59%和35.40%；Proteobacteria为第2大优势菌门，相对丰度为6.60%～33.29%，该菌门在植物土壤中较为常见，可能是沙棘果在采摘过程中携带环境微生物所致。随着发酵的进行，在中期（F22_H）和后期（F22_Z）阶段，该Proteobacteria呈增加趋势，由此也可以看出，沙棘酵素自然发酵过程中细菌群落结构的不均一性。

基于属水平细菌群落结构差异性分析

在属水平上沙棘酵素在自然发酵过程中细菌群落结构如图7所示，其相对丰度大于1%的细菌属共有5种，分别为：norank_f__norank_o__Chloroplast、雷尔氏菌（Ralstonia）、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_f__Mitochondria、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia。在发酵前期（F22_Q），norank_f__norank_o__Chloroplast为主要优势菌属，相对丰度达到93.28%，虽然在整个发酵过程中，该菌属丰度逐渐减少，尽管在后期（F22_H）减少至35.39%。

基于属水平不同发酵阶段热图分析

由图8可知，沙棘酵素自然发酵的3个不同阶段的样本有所差异，其中，分类水平总相对丰度排在前10 位的菌属分别为norank_f__norank_o__Chloroplast、Ralstonia、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_f__Mitochondria、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Rhodococcus、Pelomonas、Anaerocolumna、Acinetobacter、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium。3个发酵阶段的主要优势菌属相同，均为norank_f__norank_o__Chloroplast属，在发酵前期、中期和后期3个阶段占比分别为93.55%、67.67%和36.46%；除发酵后期（F22_H）第2优势菌属为norank_f__Mitochondria外，其他两个阶段（F22_Q、F22_Z）的第2大菌属均为Ralstonia。

β多样性分析

样本层级聚类分析：为研究沙棘酵素自然发酵不同阶段群落结构的相似性或差异关系，对3个发酵阶段群落距离矩阵进行聚类分析。如图9所示，3个发酵阶段可聚为两类，即F22_Q和F22_Z聚为一类，F22_H聚为一类，总体而言，在前期和中期发酵的细菌群落结构较为相似，原因可能是这两个时期溶液的渗透压比较大，而后期随着微生物的生长和代谢，使其环境发生变化，从而细菌的丰度产生差异。

沙棘酵素自然发酵液中细菌群落PC：基于属水平，对沙棘酵素发酵液中菌属进行PCA，结果如图10所示，PC1的贡献率为28.68%，PC2的贡献率为20.43%。在PCA中，各个点之间的距离越大，表明它们之间的菌群差异越大。反之，样本点越接近，表明两样本物种组成则越相似。在3个平行样本中，F22_Q的样本之间距离非常小，表明发酵初始阶段组内的差异非常小，而F22_Z和F22_H组内距离较大，说明这两个样本的组内差异较大。

沙棘酵素发酵中还原糖、乙醇和pH值与优势菌属间的相关性

由图11可知，细菌的群落结构中相对丰度大于1%的优势菌属与发酵过程中还原糖含量、乙醇体积分数和pH值指标间具有一定的相关性。其中，沙棘酵素发酵前期的norank_f__norank_o__Chloroplast和norank_f__Mitochondria与还原糖含量呈显著正相关（P＜0.05），与乙醇体积分数和pH值呈显著负相关（P＜0.05），而发酵中后期的Ralstonia和unclassified_k__norank_d__Bacteria则正好相反，即与还原糖含量的变化呈显著负相关（P＜0.05），与乙醇体积分数和pH值则呈显著正相关（P＜0.05）。

结 论

通过Illumina MiSeq测序对沙棘酵素自然发酵前期（F22_Q）、中期（F22_Z）和后期（F22_H）3个时期样本进行分析，根据分类单元个数统计得744个OTU，25个门，42个细菌属。在门水平上共有5种优势菌门，分别为Cyanobacteria、Proteobacteria、unclassified_k__norank_d__Bacteria、Acidobacteriota、Firmicutes，其中，Cyanobacteria为绝对优势菌门，在3个发酵阶段的相对丰度分别为93.28%、66.59%和35.40%；在属水平上共有5种优势菌，分别为norank_f__norank_o__Chloroplast、Ralstonia、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_f__Mitochondria、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，其中，norank_f__norank_o__Chloroplast菌属在整个发酵过程相对丰度均处于领先地位，其相对丰度范围为35.39%～93.28%；通过β多样性中的样本层级聚类分析和PCA得出，3个发酵阶段可聚为两类，F22_Q和F22_Z聚为一类，F22_H为一类。这为后续沙棘酵素的发酵提供重要理论基础，同时对沙棘酵素的生产工艺等具有深远影响。本研究揭示了沙棘酵素自然发酵过程中细菌群落的动态演替，为研制高效酵素发酵剂，提高沙棘酵素产品质量提供了的理论基础。

本文《高通量测序分析沙棘酵素自然发酵过程中细菌多样性》来源于《食品科学》2022年43卷8期158-165页，作者：张琪，朱丹，牛广财，颜飞翔，魏文毅，朱磊，王思溥。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210128-326。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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