科学家破解蛋白低复杂度无序区致病突变的分子动态

责编｜酶美

蛋白低复杂度结构域（low complexity domain,LCD）在生物体内广泛存在，因未能在正常生理状态下形成稳定的三维结构而一直被认为处于无结构状态，是固有无序域（intrinsically disordered region,IDR）。但LCD具有重要的生物学功能，例如形成核孔的中央选择性渗透性屏障；帮助中间纤维细胞骨架正确组装；通过其相分离或相变功能参与各种生物学功能特异的无膜细胞器（membraneless organelle,MLO）或生物分子凝聚体（biomolecular condensate）的形成等。同时，LCD也与诸多神经系统疾病和癌症的发生紧密相关。然而关于LCD如何在体内完成正常生物学功能以及从生理状态转变到疾病状态的分子机制仍有疑问。

2022年7月1日，Science期刊以长文形式在线发表了美国德克萨斯大学西南医学中心Steven McKnight教授课题组题为Mutations linked to neurological disease enhance self-association of low complexity protein sequences的研究文章。期刊还特别邀请了生物化学学家、美国四院院士Gregory Petsko教授和神经生物学家Scott Small教授为该研究撰写了题为Elucidating the causes of neurodegeneration的评注性文章。

Steven McKnight教授课题组长期致力于研究蛋白低复杂度结构域参与生物学功能及其导致疾病发生的分子机制。该课题组及领域内许多科学家都发现，许多蛋白的LCD需要通过自相互作用（self-association）来完成其生物学功能，并且在体外研究中这些LCD能够形成cross-b 结构。虽然这样的结构一直被认为是与神经退行性疾病相关的病理性蛋白相互作用结构，然而也正是这样的结构激发了Steven McKnight教授课题组对于LCD的一系列研究，尝试在分子机制层面回答LCD如何形成特异性相互作用完成其特定生物学功能，发生在特定位点或局部区域的蛋白翻译后修饰如何调控LCD之间的相互作用，以及为何特定位点发生单点突变或异常修饰后会导致疾病发生等基本科学问题。

“无序之中的有序”——能响应单个氢键变化的局部动态结构

在此研究中，作者首先以RNA结合蛋白TDP-43为研究对象，尝试理解其LCD形成相分离的分子机理。TDP-43是一个典型的通过其LCD相分离功能在细胞内形成功能性RNA颗粒（RNA granule）和在体外形成相分离液滴（liquid-like droplet）的蛋白。同时，TDP-43 LCD相互作用发生异常时也会导致神经退行性疾病。McKnight实验室在之前的研究中【1】（第一作者为现清华大学研究员吝易博士），通过测定TDP-43 LCD上不同位置的甲硫氨酸对于H2O2氧化的敏感程度差异，定位了一段在进化上高度保守、在相分离发生后被保护的核心区域（此区域中的甲硫氨酸不易被H2O2氧化），并且此区域对相分离功能至关重要【1】。与许多其它蛋白的LCD形成的相分离亚细胞结构性质相似，TDP-43在体内形成的RNA颗粒以及在体外形成的相分离液滴具有液体属性（liquid-like），提示了LCD之间特异但又动态可逆的相互作用性质。

据此，作者产生了一个大胆的猜想，TDP-43 LCD相分离核心区域或许形成了动态的、类似cross-b 的结构来实现LCD之间的自相互作用。然而验证此猜想面临的首要问题是如何测定TDP-43 LCD相分离时的动态结构。因为现有的任何蛋白结构解析和测定方法都需要蛋白形成稳定结构，或是不能兼容相分离蛋白样品。为避开这些直接测定结构方法的限制，作者将目光聚焦于形成蛋白二级结构所必需的肽主链间氢键作用。作者通过引入非天然氨基酸，利用多肽合成和化学链接等技术，建立了能够在不改变蛋白其它性质的前提下阻断特定氨基酸位点处肽主链间氢键作用的通用型方法（图1）。作者利用此方法系统性地筛查了TDP-43 LCD相分离核心区域中每个氨基酸位点处形成肽主链间氢键作用对于相分离功能的影响。结果显示，有些氨基酸位点处单个肽主链间氢键作用的缺失就能显著削弱TDP-43 LCD的相分离能力，而且这样的氨基酸位点都连续集中于一小段局部区域。此结果不仅准确定位了一段需要形成肽主链间氢键作用网络来完成TDP-43 LCD相分离功能的局部区域，也揭示了蛋白动态结构介导了TDP-43 LCD发生相分离时的特异性自相互作用。

图1

“意料之外，情理之中”——脯氨酸在TDP-43 LCD中的特殊重要性

在研究中，作者意外发现脯氨酸对于TDP-43 LCD的相分离功能极其重要。当位于相分离核心区域中的脯氨酸（P320）突变成其它氨基酸后都会导致蛋白发生严重聚集，摧毁了TDP-43 LCD的正常相分离功能。而突变位于相分离核心区域之外的其它脯氨酸对于TDP-43 LCD正常相分离功能无任何影响。严重聚集的行为提示了TDP-43 LCD之间异常增强的相互作用，此脯氨酸突变造成的影响甚至远大于位于TDP-43 LCD上的神经退行性疾病致病突变体M337V。作者尝试了在培养的细胞内表达此脯氨酸突变体，发现其导致了细胞死亡，这也解释了为何人类遗传学研究未能在疾病中发现此脯氨酸位点突变体。脯氨酸是一个性质特殊的天然氨基酸，它特殊的环形侧链阻断了其氨基作为氢键供体参与形成肽主链间的氢键作用力。除此之外，脯氨酸的特殊性还在于其特殊的刚性几何构象和形成肽键时即能形成cis-构象也能形成trans-构象以及能在两种构象间转换。作者实验发现，当用非天然氨基酸阻断突变体位点处的主链间氢键作用后， TDP-43 LCD恢复了形成相分离液滴的功能，说明TDP-43 LCD利用了脯氨酸不能形成肽主链间氢键的性质来平衡LCD之间的动态相互作用，也进一步佐证了LCD之间形成的动态结构对于主链间相互作用的敏感性。

“一个氢键引发的病变”——蛋白无序区中脯氨酸位点突变体导致蛋白功能异常的原因

人类遗传学研究发现，蛋白固有性无序区中的特定脯氨酸位点发生突变导致疾病发生的现象较为普遍，并且这些脯氨酸位点突变体的病理特征具有一定的相似性，即它们都导致了蛋白因异常增强的相互作用而形成聚集。在此研究中，作者选取了神经细胞中的中间纤维细胞骨架蛋白neurofilament light、通过相分离功能参与细胞内RNA granule形成的蛋白hnRNPA2和微管相关蛋白tau作为研究对象。作者在此前的研究中发现neurofilament light蛋白的无序区通过形成动态结构来帮助中间纤维细胞骨架正确组装，并且通过蛋白翻译后修饰阻断无序区之间的相互作用来实现中间纤维的可控解聚。导致退行性疾病的脯氨酸位点（P8和P22）突变体都异常地增强了无序区之间的自相互作用【2】。在作者之前的另一研究中，作者通过固态赫兹共振方法鉴定了hnRNPA2 LCD形成cross-b 相互作用的核心区域【3】。位于此核心区域的疾病相关突变体（D290V和P298L）已被证明能够明显增强LCD之间的自相互作用。关于tau蛋白与神经系统疾病之间的密切关系已有广泛研究，其致病突变体P301L/S/T也被发现都能够增强tau蛋白聚集【4】。在此研究中，作者利用非天然氨基酸抑或阻断致病突变位点处肽主链间氢键作用，抑或干扰脯氨酸cis-或trans-构象，从而研究了共计10个来自上述三个蛋白的脯氨酸位点致病突变体的致病机理。实验结果显示，阻断致病突变位点处的单个肽主链间氢键便可恢复蛋白的正常功能，这也再次说明这些蛋白利用脯氨酸来阻断连续的肽主链间氢键作用网络。当脯氨酸被突变后而导致额外的肽主链间氢键作用时，便会显著增强蛋白的自相互作用（图2）。

图2

总结与展望

作者为研究蛋白无序区之间动态可逆的相互作用分子机制，建立了特异性阻断肽主链间单个氢键的蛋白半合成通用型方法，并且通过此方法发现蛋白无序区之间可通过局部区域形成动态结构来完成其生物学功能 。此外，作者也鉴定了位于蛋白自相互作用区域的脯氨酸对于保持结构动态特性的重要性以及脯氨酸位点致病突变体改变蛋白正常功能的分子机理。人体约20%左右的蛋白含有长段无序区。作者实验室的研究所涉及的不同蛋白无序区都采用了相似的分子机制实现特异性相互作用，但其功能涉及了生物相分离【1, 3】、细胞骨架组装【2】以及核孔中央屏障形成【5】等在内的多个生物学过程。因此，作者推测细胞内还有很多固有性无序的蛋白序列通过类似的分子机制参与了种类丰富的生物学过程。

此研究第一作者为西南医学中心Steven McKnight实验室的周晓明博士，Steven McKnight和Glen Liszczak教授为文章共同通讯作者。这是周晓明博士既对中间纤维丝低复杂结构域的结构与功能研究后（参见：PNAS | “乱中有序”—低复杂度序列与相变），又一力作。

https://doi.org/10.1126/science.abn5582

制版人：十一

参考文献

1. Lin, Y., Zhou, X., Kato, M., Liu, D., Ghaemmaghami, S., Tu, B.P., and McKnight, S.L. (2020). Redox-mediated regulation of an evolutionarily conserved cross-beta structure formed by the TDP43 low complexity domain.Proc Natl Acad Sci U S A117, 28727-28734. 10.1073/pnas.2012216117.

2. Zhou, X., Lin, Y., Kato, M., Mori, E., Liszczak, G., Sutherland, L., Sysoev, V.O., Murray, D.T., Tycko, R., and McKnight, S.L. (2021). Transiently structured head domains control intermediate filament assembly.Proc Natl Acad Sci U S A118. 10.1073/pnas.2022121118.

3. Murray, D.T., Zhou, X., Kato, M., Xiang, S., Tycko, R., and McKnight, S.L. (2018). Structural characterization of the D290V mutation site in hnRNPA2 low-complexity-domain polymers.Proc Natl Acad Sci U S A115, E9782-E9791. 10.1073/pnas.1806174115.

4. Chen, D., Drombosky, K.W., Hou, Z., Sari, L., Kashmer, O.M., Ryder, B.D., Perez, V.A., Woodard, D.R., Lin, M.M., Diamond, M.I., and Joachimiak, L.A. (2019). Tau local structure shields an amyloid-forming motif and controls aggregation propensity.Nat Commun10, 2493. 10.1038/s41467-019-10355-1.

5. Shi, K.Y., Mori, E., Nizami, Z.F., Lin, Y., Kato, M., Xiang, S., Wu, L.C., Ding, M., Yu, Y., Gall, J.G., and McKnight, S.L. (2017). Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.Proc Natl Acad Sci U S A114, E1111-E1117. 10.1073/pnas.1620293114.

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