FSHW | 异硫氰酸荧光素标记法研究枸杞多糖在大鼠组织中的分布

Introduction

枸杞（L.barbarum）因其具有抗衰老、抗氧化、抗糖尿病、抗癌、细胞保护、神经保护和免疫调节作用等健康益处而被用作药物或药用和功能性食品。枸杞多糖（LBPs）是从枸杞中分离得到的主要成分，对枸杞的生物活性起着重要作用。作为一种天然存在的化学物质，LBPs是一组分子量（Mw）为3-2 300 kDa的水溶性糖缀合物。由于LBPs具有多种药理作用，包括抗氧化、抗衰老、免疫调节、改善肠道菌群和生殖保护，LBPs已在中国的健康食品和药物中得到广泛应用。尽管已经对LBP进行了全面的药理学研究，但鉴于这些化合物的高分子量，关于这些化合物在体内的组织分布研究的信息仍然有限。因此，详细了解其作用机制对于了解其生物活性非常重要。

大多数已发表的关于多糖药代动力学和组织分布的研究使用了许多分析方法来跟踪体内多糖，包括荧光标记结合色谱、同位素标记、分光光度法、荧光分光光度法和生物测定法。最近，基于荧光检测的技术因其特异性、灵敏度和低检测阈值而被用于药物微量分析。异硫氰酸荧光素（FITC）是荧光免疫分析中常见的荧光探针，广泛用于蛋白质的荧光标记。FITC是一种用于与其他类型的生物材料或生物分子结合成像的示踪剂。LBPs是一种水溶性蛋白质-多糖复合物，由葡萄糖、甘露糖和半乳糖醛酸聚合而成。由于异硫氰酸酯基（N=C=S）与氨基的高反应性，FITC广泛用于蛋白质标记。用FITC对LBPs中的游离氨基进行修饰，得到具有共价结合荧光素和糖基的可溶性共聚物。我们已根据高效凝胶渗透色谱荧光检测（HPGPC-FD）方法成功合成了FITC标记的LBPs，荧光标记产品（LBP-FITC）的Mv与LBPs相比没有增加。

本研究在FITC预标记的基础上建立了LBP的定量测定方法，并对其在大鼠体内的组织分布进行了研究。了解LBP在体内的组织分布及其潜在的作用靶点具有重要意义，有助于进一步研究其药理活性。

Results and discussion

定量分析方法的建立和验证

标准曲线图

测定加入LBP-FITC标准溶液和相同体积的PBS得到的样品，并记录荧光强度。根据标准曲线，LBP-FITC在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、小肠、大肠和骨骼肌中的线性范围为0-25μg/mL。各主要组织的标准曲线如表1所示。各生物组织样品的线性回归方程的相关系数均大于0.99，表明该线性方程满足药代动力学研究的要求。

表1 生物样品的线性回归方程和相关系数

精度

根据QC样品，计算了实验的精度。LPB-FITC质控样品的实验结果符合生物样品测定的相关要求。大鼠内脏组织LBP-FITC的日内和日间精密度（%RSD）均低于15%。表2显示，心脏组织LBP-FITC的日内相对标准偏差%RSD介于1.85%和4.18%之间，而日间%RSD值介于5.42%和2.86%之间。肝组织的日内精密度（%RSD）范围在3.15%到4.94%之间，日内精密度（%RSD）范围在4.28%到7.68%之间。

可以看出，肾组织三个水平的日内精密度（%RSD）为1.53%至4.82%，日间精密度（%RSD）为2.69%至6.05%；胃组织的日内精密度为1.78%～4.63%，日间RSD为3.02%～5.89%；脾脏组织中浓度的日内相对标准偏差（%RSD）为2.90%至5.62%，日间标准偏差为3.85%至6.78%。同样，LBP-FITC在大鼠肠组织和肌肉组织中的日内和日间精密度（%RSD）均低于15%。由于观察到的相对标准偏差（%RSD）不超过15%，因此该方法被证明对分析物是精确的。

表2 LBP-FITC在大鼠组织中的精确度（n=5）

稳定性

室温保存24h，冻融3次，-20℃低温保存15d，测定荧光强度。通过分析上述三种条件，评估LBP-FITC的稳定性，如表3所示。根据血浆标准曲线计算质控样品浓度，用SPSS软件计算RSD值。从表中可以看出，在这些条件下，大鼠心脏、肝脏、肾脏、胃、脾脏、小肠、大肠和肌肉组织的样品浓度的RSD值在可接受范围内（低于15%），表明样品的稳定性良好。

表3 LBP-FITC在大鼠组织中的稳定性（n=5）

回收率和基质效应

大鼠组织样品中LBP-FITC的提取回收率通过添加不同浓度LBP-FITC的QC组织样品进行评估，特别是低浓度（0.5 μg/mL）、中浓度（5.0 μg/mL）和高浓度（25.0 μg/mL）。样品回收率结果如表4所示。大鼠组织样品的回收率在94.4%~102.4%之间，RSD在1.48%~9.58%之间，表明提取回收方法和仪器测量满足生物样品分析的要求。

表4 LBP-FITC在大鼠组织中的恢复

组织分布研究

通过灌胃给予大鼠100mg/kg LBP-FITC，分别于1、6和24 h处死大鼠。测定大鼠组织中LBP-FITC的浓度。给药后1、6和24 h，LBP-FITC在血浆和组织中的浓度如表5所示。

表5 大鼠以100 mg/kg（μg/g或μg/mL）口服LBP-FITC后1、6和24 h的LBP-FITC组织浓度

1-h的组织分布

如表5和图1所示，LBP-FITC在给药1小时后主要集中在胃和小肠，小肠中的浓度最高。LBP-FITC在小肠、胃、肝、大肠、心脏和肾脏中的浓度高于血浆中的浓度，但在脾脏和肌肉中的浓度低于血浆中的浓度。上述器官和血浆中LBP-FITC浓度的比值分别为17.0,10.7,3.6,3.1,2.3,1.5；组织中LBP-FITC含量的顺序为：小肠>胃>肝脏>大肠>心脏>肾脏>血液>脾脏>肌肉。

6-h的组织分布

肾脏LBP-FITC含量在给药6小时后最高。LBP-FITC在肾脏、大肠、胃、肝、小肠和心脏中的浓度高于血浆中的浓度，而在脾脏和肌肉中的浓度仍低于血浆中的浓度。上述器官和血浆中LBP-FITC浓度的比值分别为16.2,8.5,6.2,5.9,2.6,1.6；LBP-FITC在组织中的含量顺序为：肾>大肠>胃>肝>小肠>心脏。与给药后1小时的浓度相比，LBP-FITC在血浆、胃、小肠、心脏、脾脏和肌肉中的浓度分别降低了28.5%、58.8%、89.2%、51.7%、79.0%和82.1%，而在肾脏、肝脏和大肠中的浓度分别为7.9%、1.2%和7.9%，比给药后1小时高2.0倍。

24-h的组织分布

给药24小时后，LBP-FITC的含量在大肠最高，其次是肝脏。大肠、肝脏和肾脏中的浓度高于血浆中的浓度。LBP-FITC在上述器官和血浆中的浓度比分别为：3.2、3.1和2.6；各组织的含量顺序为：大肠>肝脏>肾脏>肌肉>胃>心脏>小肠>脾脏。与给药6小时后组织中的LBP-FITC浓度相比，肌肉中的LBP-FITC浓度升高，而其他组织中的LBP-FITC浓度降低。

图1 给大鼠口服LBP-FITC 100 mg/kg后1、6和24 h，LBP-FITC在大鼠组织和血液中的分布

Conclusion

本报告是首次通过FITC荧光标记对LBPs进行研究，以揭示其在大鼠口服给药后的重要基本组织分布。该实验证明LBP-FITC主要被小肠和胃吸收，主要通过肾脏通过尿液排泄；LBP组织分布的这种明显差异可归因于这些LBP的大小与肾脏和肝脏血管床的孔径有关。本研究的结果为LBPs的传统使用提供了额外的科学数据，这些知识将使我们能够全面了解口服LBPs后的生物学效应。

一

第一作者简介

杨超，男，医学博士，东南大学公共卫生学院在读博士，主要研究方向：人类营养与健康；肠道菌群与非酒精性脂肪肝；目前以第一作者发表SCI论文9篇，在读期间获得江苏省创新人才计划项目和东南大学优秀博士培育基金项目资助。

二

通信作者简介

孙桂菊，女，东南大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，系主任，二级教授、博士生导师。2001年7月，毕业于复旦大学公共卫生学院，获医学博士学位；曾在美国德克萨斯理工大学、德国联邦食物中心营养与生化研究所、德国乌尔姆大学、美国约翰霍普金斯大学公共卫生学院做访问学者；现任中国营养学会理事；江苏省营养学会副理事长；中国营养学会营养与保健食品分会委员；中国营养学会基础营养分委会副主任委员；国家食品药品监督管理总局保健食品评审专家；国家卫生与计划生育委员会新食品原料评审专家。近年来主持和参与多项国家及省部级课题。主要研究方向食品安全与食品功效、营养与慢性病，具有较高的学术造诣。2009年度获南京市科技进步奖一等奖和江苏省科技进步奖三等奖，在国内外学术期刊发表论文150余篇。

Tissue distribution of Lycium barbarum polysaccharides in rat tissue by fluorescein isothiocyanate labeling

Chao Yang, Hui Xia, Huali Tang, Ligang Yang, Guiju Sun*

Key Laboratory of Environmental Medicine and Engineering of Ministry of Education, and Department of Nutrition and Food hygiene, School of Public Health, Southeast University, China-DRIs Expert Committee on Other Food Substances, Nanjing 210009, China

*Corresponding author.

E-mail address: gjsun@seu.edu.cn

Abstract

To date, in vivo investigations of polysaccharide’s pharmacokinetics are significantly restricted by the difficulty in their detection. This study was conducted to establish the quantitative determination of Lycium barbarum polysaccharides (LBPs) based on fluorescein isothiocyanate (FITC) pre-labeling and to investigate their tissue distribution in rat. We obtained the calibration curves linear over the range of 0–25 µg/mL in rat tissue samples with correlation coefficients greater than 0.99. The inter-day and intra-day precisions (RSD, %) were within 15%, and the relative recovery ranged 95.2%–102.4%, with RSD range 1.48%–9.58%, indicating that this experiment was suitable for the determination of LBPs. The fluorescence intensity was measured after 24 h storage at room temperature, 3 times of freeze-cycle and cryopreservation at –20 °C for 15 day, these results indicated that the stability of the samples was good. LBP-FITC was mainly absorbed by the small intestine and stomach, and mainly excreted in the urine through the kidney; this distinct difference in the tissue distribution of LBPs could be attributed to the size of these LBPs in relation to the pore sizes of the vascular beds in the kidney and liver. Results showed in this study enable us to comprehensively understand the biological effects of LBPs following its oral ingestion.

Reference:

YANG C, XIA H, TANG H L, et al. Tissue distribution of Lycium barbarum polysaccharides in rat tissue by fluorescein isothiocyanate labeling[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(4): 837-844. DOI:10.1016/j.fshw.2022.03.004.

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意