Nature Commun. | 新型自然变异！福建农林大学廖红/陈志长团队揭示uORF自然变异导致大豆磷效率的多样性

责编 | 奕樊

磷是作物必需的大量营养元素。磷元素极易被土壤固定从而导致有效磷的缺乏，大豆作为重要的豆科作物，磷元素的缺乏严重影响大豆生物固氮和生长发育，提高大豆自身的磷吸收效率是解决磷缺乏问题的一条有效途径。然而磷效率是一个复杂性状，遗传研究和改良的进展缓慢。另一方面，先前的研究报道，作物自然变异的遗传基础主要关注基因的转录水平（比如启动子的变异）和蛋白序列（比如非同义突变或提前终止）两个方面，转录后水平或翻译效率方面的自然变异还鲜有报道。

7月1日，福建农林大学廖红/陈志长团队在Nature Communications发表了题为“A natural uORF variant confers phosphorus acquisition diversity in soybean”的研究论文，发现并证实位于基因5’UTR开放阅读框（uORF）的一个碱基变异导致了大豆群体磷吸收效率水平的多样性。

该研究利用前期收集的大豆磷效率应用核心种质资源，开展了全基因组重测序获得了高密度的分子标记；并开展了田间表型鉴定，获取了磷效率相关的表型指标。然后针对植株磷含量进行了全基因组关联分析（GWAS），没有鉴定到显著且背景干净的关联信号；考虑到磷含量与植株总根长的相关性，为了提高GWAS的检测力，研究者引入总根长作为协变量再次对磷含量进行GWAS, 发现在20号染色体上出现了一个新的显著关联位点。研究者推断该位点不影响根长，是通过影响根的吸收效率从而影响磷的吸收量。基于此衍生了一个新的磷吸收效率的表型指标，即单位根长的磷吸收量（植株磷含量/总根长），针对该指标开展GWAS，鉴定到一个显著且背景干净的关联信号，正是上述位于20号染色体的位点，命名为CPU1(component of phosphorus uptake 1)。

通过对位点内基因的组织表达谱信息调查和序列同源分析，初步确定SEC12-like蛋白的编码基因GmPHF1为CPU1位点的候选基因。为了确定该基因的功能，分别构建了大豆RNAi和超表达稳转材料，并进行磷效率表型分析，结果显示该基因影响根的磷吸收效率而不影响总根长；进一步通过LA-ICP-MS证实了该基因在磷吸收方面的功能。GmPHF1与其水稻和拟南芥同源基因一致，蛋白定位于细胞内质网。位于细胞内质网的蛋白是如何影响根从土壤中吸收磷？研究者通过毛根转化和稳定转化发现并证实了GmPHF1与根中特异高表达的磷转运蛋白GmPT4之间的遗传关系。进一步通过免疫染色发现GmPHF1帮助GmPT4从根表皮细胞内质网转移至细胞膜；同时研究者发现了GmPT4是以极性的方式定位于细胞膜，行使其从土壤中吸收磷的功能。

GmPHF1的功能变异位点在哪里？是表达量的变异还是氨基酸序列的变异？研究者开展了GmPHF1候选基因关联分析，发现关联信号集中在启动子和5’UTR。基于这些显著的变异位点将该基因分成了两种主要的单倍型：与磷低效单倍型（H1）相比，高效单倍型（H2）提高根的磷吸收效率达38.64%。进一步分析发现5’UTR内含有一个开放阅读框（uORF），存在的两个显著SNPs (SNP476和SNP413)正好位于该uORF，SNP476导致氨基酸的变化，SNP413引入终止密码子，导致uORF的提前终止（高效单倍型（H2）和低效单倍型（H1）分别对应着120 bp和84 bp的uORF）。两个SNP完全连锁不平衡(r2=1)且是高频变异位点（MAF=0.49）。研究者构建了不同单倍型启动子和5’UTR的重组载体，通过Western试验和免疫染色试验证实了功能变异位点存在于5’UTR，含有较长uORF的H2单倍型对应着较高的GmPHF1蛋白含量。

最终引起变异的是5’UTR中哪一个SNP，还是两个SNPs同时发挥作用？SNP影响下游GmPHF1的翻译是否依赖uORF？为了解决这个问题，研究者构建两个SNPs不同基因型的重组载体，结果发现导致uORF长度变化的SNP413才是真正的功能变异位点。当人为突变uORF的起始密码子（ATG→AAA），无论SNP413是哪一种基因型，都无法检测到下游GmPHF1的翻译，说明SNP413是通过uORF来调控下游GmPHF1的翻译。免疫染色结果显示SNP413不仅影响蛋白的翻译量还影响着其空间分布, 这可能与uORF的组织特异性相关。最终研究者通过遗传稳定转化，将GmPHF1的高效等位基因转入到大豆中，大豆的磷吸收效率得到显著提高，直接证实了SNP413在表型上的功能，也显示了其在育种方面的价值。

综上所述，该研究通过GWAS鉴定到一个uORF的自然变异，该变异影响下游GmPHF1的蛋白含量和空间分布，从而影响磷转运蛋白GmPT4从内质网向细胞膜的转移，最终形成大豆群体磷吸收效率的差异。

福建农林大学青年教师郭子龙副教授和在读博士生曹红瑞为本文共同第一作者，廖红和陈志长教授为共同通讯作者。福建农林大学孙丽莉副教授和华南农业大学的田江、王秀荣、赵静教授参与了此项工作。本研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金重点项目和青年项目的资助。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-022-31555-2