AKT信号通路调控无义介导的mRNA降解

撰文 | 言笑

无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）是一种真核细胞质量控制机制，识别并降解开放阅读框中含有提前终止密码子（premature termination codon,PTC）的mRNA，避免因编码和累积截断体蛋白而对细胞造成的毒害【1】。NMD 在破坏有缺陷的致病mRNA和维持正常的生理mRNA丰度方面有重要作用。在pre-mRNA 剪接过程中，外显子拼接复合物（exon-junction complex,EJC） 定位在剪接的外显子-外显子连接上游约20-25-nts处。EJCs有两种构成方式：（1）EJC核心组分（eIF4A3、RBM8A 和 MAGOH）+RNPS1，RNPS1可以同时招募UPF3X和 UPF2以触发UPF2依赖的NMD；（2）EJC核心组分+CASC3，CASC3只招募UPF3X不招募UPF2【2】。尽管已有研究表明会发生不依赖于UPF2的NMD【2】，但UPF2具有将UPF1从封闭构象转变为开放构象的重要功能【3】，那么在UPF2缺失的情况下“谁”可以代替它的功能，目前尚未知晓。

NMD途径的关键是PTC的识别。当至少有一个外显子-外显子连接位于PTC下游>50-55-nts时，终止核糖体无法去除结合的EJC，从而触发NMD。紧接着，UPF1（ATP依赖性RNA解旋酶）及其激酶SMG1在终止核糖体处组装并移动到EJC。然后，SMG1过度磷酸化UPF1的N和C端，高磷酸化的UPF1（p-UPF1）可以（1）抑制进一步的翻译起始【4】；（2）招募内切酶SMG6和SMG5-SMG7复合物去降解NMD靶标【5】；（3）重塑mRNP以解决降解过程中的停顿【6】。最近又发现了一些新的调节NMD活性的蛋白，凸显了NMD的复杂性。例如SMG8和SMG9抑制SMG1的激酶活性【7】；DHX34和NBAS共同调控NMD敏感性转录本【8】；PTBP1和hnRNPL各自屏蔽来自NMD的具有长和/或结构化3’UTR的特定转录本【9】。也有研究显示，细胞内钙水平、未折叠的蛋白质反应和一般应激反应都抑制NMD。但目前在哺乳动物细胞中鉴定调节NMD活性的NMD因子的遗传方法仍然很少。

近日，来自美国罗切斯特大学的Lynne E. Maquat团队在Molecular Cell杂志在线发表了题为AKT constitutes a signal-promoted alternative exon-junction complex that regulates nonsense-mediated mRNA decay的文章。研究人员通过开发NMD效应物的单倍体细胞遗传筛选方法，鉴定了13个潜在效应物，它们构成了AKT信号通路。AKT信号在含有CASC3的EJCs中功能性地取代了UPF2，通过磷酸化UPF1 T151将UPF1 CH（半胱氨酸-组氨酸）结构域从封闭构象转变为有利于解旋酶活性的开放构象，进而促进NMD。临床相关性方面，研究人员证实脆性X染色体综合征（Fragile X syndrome, FXS）中的NMD过度激活部分归因于AKT信号通路的上调。

首先，作者设计并构建了反映NMD活性的报告系统。作者使用了部分TCRb转录本，包括JC intron（joining J和constant C segments之间的内含子）。为了能利用荧光活化单细胞分选（fluorescence-activated single-cell sorting, FACS）识别NMD效率的变化，作者将3×FLAG mCherry放置在TCRb的上游，使翻译终止于3×FLAG mCherry的终止密码子，产生3×FLAG-mCherry荧光，触发NMD，并阻止蛋白的产生。作为对照，作者在TCRb序列两侧插入了LoxP位点，可被Cre重组酶识别。另一个对照是缺少JC intron的版本Δ (JC intron)，对NMD免疫。3×FLAG-mCherry NMD reporter转录由双向CMV IE启动子驱动。在HEK293T细胞中转染这些reporters后进行检测，结果显示：（1）3×FLAG-mCherry NMD reporters已充分表达并可用于生化和 FACS 分析；（2）消除 NMD 的Δ (JC intron) 使蛋白质和荧光增加了 约10 倍。

通过慢病毒将NMD reporters送入HAP1细胞。Reporter单克隆细胞系需满足两个标准：（1）FACS可检测到足够的3×FLAG-mCherry 荧光；（2）当NMD被破坏时，3×FLAG mCherry荧光增加。作者将Adeno-Cre递送到带有+ (JC Intron) NMD reporter的细胞中，删除TCRb序列，使reporter转录本对NMD免疫，进而可筛选荧光显著增强的单克隆。经过第一轮筛选，Adeno-Cre介导的JC intron缺失使HAP1 P6_9细胞系中3×FLAG-mCherry reporter产生的蛋白量增加了2.1倍。使用HAP1 P6_9进行第二轮克隆分离和筛选，最终获得了reporter细胞系P6_9_E12。与模拟感染相比，P6_9_E12细胞缺失JC intron后，FACS荧光增加了10倍。基因诱捕逆转录病毒（gene-trap retrovirus）整合到编码NMD反式效应子的基因中将抑制NMD活性，导致3×FLAG mCherry蛋白和荧光的增加。通过上述筛选策略，作者鉴定了一些潜在的NMD效应物，并进行了验证，发现20个候选效应物的siRNA都抑制了NMD，其中有13个是AKT信号通路的组分。

已有研究表明NMD在转染pan-AKT siRNA的HeLa细胞中受到抑制，在用AKT抑制剂处理或AKT1基因缺失的HEK293FT细胞中也受到抑制。作者发现，用siRNA下调筛选实验中鉴定到的7种AKT信号效应因子中的每一个，都会抑制NMD。在AKT IP中未检测到 RNPS1 和 UPF2，但检测到了UPF3X，作者因此推测AKT可能是alternative EJC的一部分，并可能以某种方式功能性地替代UPF2以促进UPF1解旋酶活性。通过搜索PhosphoSitePlus数据库，作者发现 UPF1 在 T151 处被磷酸化，它位于 AKT 磷酸化的共有序列 RXX(S/T)内。与MYC-UPF1R (WT) 相比，MYC-UPF1R (T151D) 和MYC-UPF1R (T151A) 均抑制ATF3、GADD45A和GADD45B mRNAs的NMD，表明UPF1 T151的磷酸化和去磷酸化的循环对高效NMD至关重要。用Afu处理表达MYC-UPF1R (WT) 或 MYC-UPF1R (T151D) 的细胞将进一步抑制NMD，但处理表达MYC-UPF1R (T151A) 的细胞时，对NMD没有进一步的影响，表明AKT对T151位点的磷酸化是其他位点发生磷酸化的先决条件。T151位于已知的UPF1调控区域内，作者发现AKT介导的UPF1 T151磷酸化可以克服UPF1自抑制，进而激活UPF1解旋酶活性。

FXS由FMRP缺失导致。FXS患者的AKT信号异常增强。由 FXS 患者成纤维细胞发育而来的诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cells, iPSC) 表现出NMD过度激活。作者探究了上调的AKT信号传导与NMD过度激活的生理相关性。使用Afu抑制FMR1-KO 神经干细胞（neural stem cells, NSCs）中的AKT信号传导，显著抑制NMD。因此，作者认为FXS中 由FMRP缺失引起的NMD超活化至少部分归因于增强的AKT信号。

最后，作者探究了AKT介导的NMD与UPF2介导的NMD之间的关系。UPF1 T151和UPF2的磷酸化作用类似地促进NMD期间的UPF1活性，并且UPF2与UPF3X不同，不能与AKT结合，表明AKT可能构成不依赖UPF2的NMD（UPF2-independent NMD）。下调 UPF2 是否会增加含有 AKT 的 EJC 的形成？反之，下调 AKT1、2 和 3是否会增加含有 UPF2 的 EJC 的形成？eIF4A3 IP显示，下调AKT不会增加eIF4A3结合的UPF2，下调UPF2也不会增加eIF4A3结合的AKT，表明含 UPF2 的 EJC 和含 AKT 的 EJC 之间不存在强制性的前体-产物（precursor-product）关系，AKT 与 EJC 的结合是一个受调控的过程，可能通过 AKT 信号传导增强。值得注意的是，ATF3、GADD45A和GADD45B mRNAs的NMD在下调所有三种AKT或UPF2时受到抑制，表明AKT和UPF2介导的途径在三种mRNA的相同分子和/或不同分子上均具有活性。更有意思的是，血清饥饿后通过胰岛素处理增强 AKT 信号，然后进行eIF4A3 IPs，AKT结合增加，UPF2结合降低，NMD效率增强。

总的来说，该研究开发了一种单倍体细胞遗传筛选来寻找尚未定义的NMD效应子，筛选中鉴定出的13个效应子构成了AKT信号通路，AKT信号通过形成另一个包含AKT的EJC来促进NMD。该研究解释了UPF1如何在缺失UPF2的NMD中发挥作用：（1）EJC-associated UPF2，含有 RNPS1的EJC 的典型代表，它与UPF1的CH结构域结合以克服UPF1自身抑制，从而促进UPF1解旋酶活性和NMD；（2）EJC-associated AKT, 含有CASC3的EJC的典型代表，它使UPF1 CH结构域中的T151磷酸化以克服UPF1自身抑制，从而促进UPF1解旋酶活性和 NMD（图2）。

图. UPF2 介导的 NMD 和 AKT 介导的 NMD

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.05.013

制版人：十一

参考文献

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