外周血免疫细胞精细分型检测的意义和应用

人的全血可以大致分为三个部分：血小板和血浆、有核细胞（或单个核细胞）、红细胞及分叶核细胞（粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞）。其中单个核细胞又可分为髓系和淋系两大部分，髓系主要就是单核细胞、粒细胞、树突状细胞。淋系就是我们常说的淋巴细胞，主要就是T、B、NK细胞（图1）。我们所说的外周血免疫细胞就是指外周血中各白细胞的统称。

图1 来源网络

精细分型意为在上述大致分型的基础上，根据各种特异性标志物将各细胞不同免疫状态下的形成的亚群（subsets）进行精细分类。顾名思义，外周血免疫细胞精细分型检测就是检测外周血中各白细胞的精细亚群。下面我们就各种免疫细胞的分类、功能引出本项目的意义。

1、淋巴细胞——T细胞

T细胞在骨髓中产生，其成熟和发育是在胸腺中，根据TCR受体不同分为αβ型和γδ型，γδ型一般是CD4-CD8-，数量比较少，TCRγδ细胞是一种非同种异体反应的“先天样”T淋巴细胞亚群（通常占循环T淋巴细胞的1-10%），能够以不依赖于 MHC 的方式识别靶标（通过几种激活受体，如γδ-TCR、NKG2D 和TLR）并显示出不同的功能，包括抗感染和抗肿瘤活性。

TCRαβ型的发育最开始是CD4-CD8-，叫double negative细胞（DN），然后胞浆表达cCD3+、CD4+CD8+，叫double positive细胞（DP），进一步进行分化选择成CD4、CD8单阳性的T细胞。

T细胞成熟后，未接触抗原的T细胞叫初始T细胞（Naive T），在抗原、抗原提呈细胞、细胞因子的刺激下，继续进一步分化，形成具有记忆性的T细胞（长期、短期），并可以归巢至淋巴结，再次遇到相同抗原刺激时，可以迅速激活细胞毒性反应。目前学术界认为记忆T细胞的发育有4种模型（图2）。

图2 引自Cells 2020, 9(3),531; https://doi.org/10.3390/cells9030531

（a）线性模型中，主要组织相容性复合物（MHC）上呈递肽的抗原呈递细胞（APC）激活初始 T 细胞后产生效应T 细胞或记忆前体细胞（黄色），进一步产生成熟的效应记忆T细胞(TEM)（红色）和中央记忆T细胞（TCM）（蓝色）。也可以产生组织驻留记忆T细胞（TRM）（绿色）。

（b）不对称模型，免疫突触的近端子细胞（初始T细胞-T细胞受体（TCR）+肽和MHC-APC）发育成TEM，而远端子细胞发育成 TCM。目前尚不清楚哪些细胞会产生TRM（绿色）。

（c）自我更新模型，效应T细胞或TCM由初始T细胞产生。然后这些自我更新的细胞可以产生TEM细胞。TRM是由自我更新的TCM/效应细胞还是由TEM产生的，目前尚无定论。

（d）同步模型，初始T细胞首先分化成不同的辅助T细胞亚群，如Th1和Th17细胞（深灰色）产生TEM，而 TFH细胞（浅灰色）产生TCM。目前尚未确定生成TRM的T辅助细胞子集。

在一些肿瘤患者中，外周血不同分化亚型的T细胞的含量可能会提示患者对临床治疗的响应以及生存预后的预测。例如，在胰腺癌患者中，CD4 naïve/记忆T细胞比值越高，生存预后越差（cut-off=0.36）。CD8naïve/记忆T细胞比值越高，对化疗的治疗响应越差。CD8naïve/记忆T细胞比值越低，PFS越长（图3）。

图3 来源Cancer Med. 2019 Mar; 8(3): 1326–1335. doi: 10.1002/cam4.1988

另有文献表明，对于B-NHL（非霍奇金淋巴瘤）完全缓解后行自体移植的患者，移植前外周血CD8+Tem（CD8+效应记忆T细胞）比例越高或CD8/CD4+Tcm比值越高，自体移植预后越差（Bone Marrow Transplant 55, 77–85 （2020））。对于CAR-T细胞治疗，血液分离产物中的T细胞亚群表型往往与PFS相关。较高的基线初始T细胞（CD27+CD45RO-CD8+）比例与CAR-T治疗持续缓解相关。

2、淋巴细胞——B细胞

B细胞是在骨髓中产生，其发育和成熟也是在骨髓中，成熟后释放至外周，成熟的B细胞以CD19+为标志，CD19+ B细胞群包含几个亚群，其特征通常以CD27和IgD分子的存在为特征，即初始B细胞（CD27- IgD+），未切换记忆B细胞（CD27+ IgD+），切换记忆B细胞（CD27+ IgD-）和晚期记忆B细胞（CD27- IgD-）。

图4 健康人群B细胞亚群特征（来自小张自己的研究数据）

最新研究表明，初始B细胞的数量可能与接种新冠疫苗后抗体的生成相关。未切换记忆B细胞又称IgM记忆B细胞，这群B细胞通过产生高亲和力IgM在二次免疫反应中至关重要，另外，其数量与类风湿关节炎（RA）患者的疾病活动和临床表现呈负相关。健康人群外周血中可见少量的CD27- IgD-晚期记忆B细胞，这种双阴性群体代表了非分裂的细胞，但仍然能够产生炎症介质，并且以这种方式可能有助于衰老相关的炎症，因此，在老年人群或一些自身免疫性疾病患者中，这群B细胞数量会呈现增加。

在成熟B细胞接受抗原刺激活化后，进而会分化为浆细胞（PC，plasma cell），以CD38强表达为标志，另外也会表达CD138、BCMA等。浆细胞具有合成、贮存免疫球蛋白的功能，参与体液免疫。

3、淋巴细胞——NK细胞

NK细胞，natural killer细胞，是一种天然免疫细胞。在对病毒的免疫和肿瘤的免疫监测中起重要作用。除了是IFN-γ的有效先天来源外，NK细胞还含有含有穿孔素和参与细胞介导的细胞毒性的颗粒素。NK细胞表达多种免疫受体，用于感知自身细胞的病理变化。

图5 引自Cell 180, March 19, 2020. DOI https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.029

在人类中，NK细胞通常被定义为CD3-CD56+细胞。人NK细胞的两种不同亚型分别为CD3-CD56DimCD16+或CD3-CD56bright CD16-。CD3-CD56DimCD16+亚群主要存在于血液中，具有很强的细胞毒性，而CD3-CD56bright CD16-亚群是淋巴结中的主要亚型，仅具有较弱的细胞毒性。

4、髓细胞——单核细胞（Monocyte）

单核细胞是血液中最大的血细胞。目前认为它是巨噬细胞的前身，具有明显的变形运动，能吞噬、清除受伤、衰老的细胞及其碎片。单核细胞还参与免疫反应，在吞噬抗原后将所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞，诱导淋巴细胞的特异性免性反应。成熟的单核细胞高表达CD14，并且CD13、CD33、HLA-DR阳性。根据CD14与CD16的表达，将成熟单核细胞分为三种——经典型、中间型、非经典型。经典单核细胞（cMo）为CD14++CD16-；中间型单核细胞（iMo）为CD14+CD16+；非经典单核细胞（ncMo）为CD14lowCD16+。

经典型单核细胞具有高吞噬能力，可有效产生炎症介质以响应细菌产物，修复组织并迁移至炎症部位，其细胞计数的峰值水平已被证明与急性心肌梗塞（AMI）后急性期心肌挽救的损害和左心室重塑不良有关。中间型/非经典型单核细胞活化可以产生促炎细胞因子例如TNFa、IL1b和IL6，以响应细菌感染，并具有在感染和抗原呈递过程中扩展的能力，在心血管疾病、类风湿性关节炎和克罗恩病等炎症和慢性疾病中比例增加。

5、髓细胞——粒细胞（Granulocyte）

粒系和单核细胞系起源于共同的祖细胞，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞与嗜碱性粒细胞。中性粒细胞（CD16++CD13++CD15++SSC大）作为血液中最丰富的吞噬细胞，是先天免疫系统中必不可少的第一道防线。成熟的中性粒细胞在杀灭和消化病原体、对损伤做出反应和介导炎症反应中发挥了重要作用，它们最早到达损伤和炎症部位，具有很强的趋化性和吞噬功能，在感染时趋化至感染部位，依赖丰富的颗粒酶、活性氧、中性粒细胞外诱捕网（NETs）等杀灭外来物质。

嗜酸性粒细胞CD45表达强，表面抗原表型类似中性粒细胞，区别在于一方面，嗜酸性粒细胞CD16-，另一方面，由于嗜酸性粒细胞由于内含嗜酸颗粒，SSC较中性粒细胞偏大，如图5所示，蓝色为中性粒细胞，棕色的为嗜酸性粒细胞。

图6 外周血各细胞亚群，Gate AU（棕色）为嗜酸性粒细胞（来自小张的数据）

外周血中嗜酸性粒细胞约占白细胞的0-5%有明显的昼夜周期性波动，清晨细胞数减少，午夜时细胞数增多。嗜碱性粒细胞含肝素和组胺等嗜碱性颗粒，表面抗原表型以CD123强表达，HLA-DR-为标志，在外周血中含量一般不会超过1%。

6、髓细胞——浆细胞样树突状细胞（pDC, plasmacytoid dendritic cell）

pDC在血液中含量极少，文献报道pDC仅占健康人外周血单个核细胞的0.2%-0.8%，占白细胞的约0.1%-0.6%。pDC可分泌大量I型干扰素（IFN）以应对病毒感染，参与先天免疫及适应性免疫。目前，随着对pDC研究的深入，pDC大量分布于多种实体瘤中，通过诱导调节T细胞产生参与免疫调节、表达PD-L1参与肿瘤免疫逃逸过程。

综上所述，我们了解了血液中各种白细胞的表型、功能及分化规律，通过对外周血免疫细胞精细分型检测，我们可以：

（1）更深入地了解机体免疫功能状态，例如确认感染性疾病及机体的免疫反应强度、评估机体免疫功能（缺陷、机能低下、亢进）；

（2）辅助临床疾病诊断，例如辅助判断免疫缺陷、自身免疫性疾病或辅助发现一些血液病；

（3）监测病程及预后，指导临床治疗方案，例如监测机体对化疗、移植或免疫治疗的响应，进行机体外周免疫重建监测、预防继发感染。

这里，我们列举一份外周血免疫细胞精细分型的检验报告单，从这份报告单可以看出外周血中各免疫细胞亚群的占比情况，同时，该份报告也给出了耗竭表型的T细胞占比情况，不仅提供了免疫功能状态评估的数据，还可以对免疫逃逸、免疫检查点治疗提出参考（图7）。

图7 外周血免疫细胞亚群精细分型检验报告单

最后，希望小张这篇文章可以给各位提供一些小小的思考。

内容来源 | 科研助手小张