扒一扒弧菌在TCBS培养基上的显色原理

TCBS琼脂培养基，英文名称Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，即硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基。在水产养殖业中，经常用于弧菌的分离与鉴定。

TCBS本身为浅绿色，用该培养基培养的弧菌颜色通常分为蓝绿色、黄色和黑色三种颜色。为什么弧菌属的细菌在TCBS培养基上显示出不同的颜色呢？

要弄清楚弧菌在TCBS培养基上的显色原理，首先要知道TCBS培养基的成分。TCBS培养及的成分配方如下图列表所示。

TCBS培养基中的蛋白胨、酵母浸粉提供碳氮源、维生素和生长因子；氯化钠可刺激弧菌的生长；蔗糖是可发酵的糖类；牛胆酸钠、牛胆粉、硫代硫酸钠和枸橼酸钠及较高的pH可抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群；霍乱弧菌、副溶血弧菌对酸性环境比较敏感，因此该pH值可增强其生长；硫代硫酸钠与柠檬酸铁反应作为检测硫化氢产生的指示剂；溴麝香草酚兰和麝香草酚兰是pH指示剂；琼脂是培养基的凝固剂。其中，麝香草酚蓝作为pH指示剂的变色范围为：1.2(红)～2.8(黄) ~8.0(黄)～9.6(蓝)。由此可知，弧菌在TCBS培养上的显色肯定与pH有关。

那么究竟弧菌是如何引起pH变化的呢？不难猜想这可能与TCBS培养基中的蔗糖成分有关。有的弧菌可以发酵蔗糖产生乳酸，pH降低，就显示黄色，有的弧菌不能发酵蔗糖产酸，菌落及周围就保持原来的颜色。

笔者查找了《2013年水生生物执业兽医资格考试指南》及相关文献，也证实了这一观点。

凡是不能发酵蔗糖的弧菌就不产酸，只能利用柠檬酸钠或枸橼酸钠作为碳源，然后生成碳酸盐，使培养基pH升高，在 TCBS培养基上都是蓝绿色（或深绿色）；能够发酵蔗糖的弧菌可以产酸，使培养基pH降低，在TCBS培养基上的颜色就为黄色。如果菌株能够产生H2S，则遇到培养基中的铁离子就会生产FeS显示黑色。

此外，笔者对以上观点还做了显色验证试验。从大连海珍品疾病防控中心的海水养殖动物病原菌库内选取了几株常见弧菌：哈维弧菌两株、副溶血弧菌与溶藻弧菌各三株，首先在NA培养基进行活化，18h后接种于TCBS培养基，然后于8h、20h、48h三个时间点进行观察并拍照记录。结果如下图所示：

结论：

1、在TCBS培养基中，副溶血弧菌为蓝绿色，哈维弧菌和溶藻弧菌为黄色，与预期结果一致。

2、在NA培养基中，溶藻弧菌呈弥散型生长，哈维弧菌与溶藻弧菌菌落形态较为规则。

3、在相关论坛中有的学者提到，显黄色的菌落随着时间的推移会将产生的酸也当做碳源分解掉，颜色会由黄再变为绿色。本人推测，这种现象发生在蔗糖消耗尽之后，也就是在平板厚度很薄的TCBS平板中才会发生，而本实验中菌株需要在培养箱内培养48h，为了防止TCBS平板风干，发生裂纹，因此制作时特意增加了厚度，故不会发生蔗糖耗尽的情况，因此，实验中也没观察到哈维、溶藻黄色菌落变绿的情况。

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