Molecular Cell | 双链DNA断裂位点的组蛋白巴豆酰化“解偶联”双链断裂诱发的转录沉默与修复

撰文 | 言笑

双链DNA断裂（Double-strand breaks,DSBs）是危害最大的DNA损伤之一，其不适当的修复将导致非常严重的后果，包括凋亡、衰老或致癌性转化【1-2】。DSB修复主要包括两类途径：无差错（error-free）的同源重组（homologous recombination, HR）；易出错（error-prone）的经典非同源末端连接（classical non-homologous end joining, c-NHEJ）、替代末端连接（alternative end joining, alt-EJ）和单链退火（single-strand annealing, SSA）。c-NHEJ和alt-EJ发生在G1、S和G2期，SSA和HR主要发生在S和G2期。DSB修复途径之间的选择取决于DSB位点的染色质状态、DSB末端切除和细胞周期【3-4】。

外源性 DSB 可诱发局部和瞬时转录沉默。ATM、DNA-PK和PARP1是DSB诱导沉默的关键决定因素，它们调控着各种沉默因子的活性，这些沉默因子要么直接影响RNA聚合酶II（RNA polymerase II, RNA Pol II）的活性，要么在DSB位点调控染色质结构【5】。例如，NELF复合物的NELF-E和NELF-A亚基优先被招募到DSBs诱导的上游转录活性基因中，以阻断Pol II的转录延伸【6】；相反，组蛋白的翻译后修饰（post-translational modification, PTMs）则参与染色质重塑以在DSB位点建立抑制环境【6】。有研究显示，在转录活性染色质上富集的组蛋白赖氨酸巴豆酰化（crotonylation, Kcr）在DNA损伤位点被电离辐射（ionizing radiation, IR）、依托泊苷（etoposide, V16）和UV辐射以组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC）依赖的方式造成局部和短暂的降低【7-8】。然而，目前尚不清楚Kcr减少是否明确地发生在DSB位点，以及它是否有助于DSB诱导的转录沉默。

DSB诱导的转录沉默可防止DSB位点的修复因子和转录因子之间的冲突，并防止当DSB发生在一个基因内时产生截断和异常转录本。此外，DSB位点抑制性染色质结构的形成限制了断裂DNA末端的迁移率，并使它们靠近以确保DSB的及时修复【5,9】。因此，人们普遍认为DSB诱导的沉默是及时修复DSB的先决条件。然而，2022年4月20日，来自以色列理工大学的Nabieh Ayoub团队在Molecular Cell杂志在线发表了题为CDYL1-dependent decrease in lysine crotonylation at DNA double-strand break sites functionally uncouples transcriptional silencing and repair的文章对当前认知提出挑战，并提供数据表明DSB诱导的沉默和修复可能独立发生。研究人员通过全基因组图谱分析，发现AsiSI 诱导的 DSB 位点组蛋白赖氨酸巴豆酰化（Pankcr）和巴豆酰化的组蛋白残基（H3K9cr）局部减少。CDYL1巴豆酰辅酶A水合酶活性在AsiSI诱导的DSBs中下调Kcr并造成转录沉默。DSBs中H3K9cr的CDYL1依赖性减少对于DSB诱导的转录沉默至关重要，但对HR完整性没有明显影响，表明DSB诱导的转录沉默对于HR完整性是可有可无的。

DSB诱导的转录沉默部分由各种PTMs的改变介导，提示组蛋白Kcr（标记转录活性染色质）可能在DSB位点下调。作者采用AsiSI（DlvA）系统来进行DSB诱导（该系统由稳定表达与雌激素受体结合域融合的细胞质AsiSI限制性内切酶的U2OS细胞组成；向培养基中添加4-羟基他莫昔芬可以促使AsiSI-ER融合蛋白迁移到细胞核中，进而诱导DSB。）【10】，并进行全基因组图谱分析，数据显示，在AsiSI诱导的DSB位点，PanKcr和H3K9cr水平显着降低。作者之前的研究证明CDYL1被招募到DSB位点并促进转录沉默。同时，CDYL1具有巴豆酰辅酶A水合酶活性，可负调节Kcr【8,11】。因此，作者推测CDYL1可能与DSB位点上Kcr减少有关。数据显示，在CDYL1缺失细胞中，AsiSI诱导的DSBs处的PanKcr水平降低，但其降低程度显著低于野生型细胞中PanKcr的降低程度，表明除CDYL1以外存在其他去巴豆酰化酶参与调节DSB位点的Kcr水平；与PanKcr不一样，H3K9cr水平在CDYL1缺失细胞内AsiSI诱导的DSBs中并没有减少，说明CDYL1是主要的H3K9cr调控因子。

随后，作者利用缺乏巴豆酰辅酶活性的CDYL1-S467A突变体，来检测CDYL1是否通过其巴豆酰辅酶A水合酶活性在DSB位点降低Kcr。S467残基位于ECH结构域内，该结构域可调节DNA损伤位点CDYL1的募集【11】，但结果显示，S467A突变既不影响CDYL1在DNA位点的招募，也不影响其多聚化。作者在CDYL1缺失DlvA细胞中表达CDYL1-WT或CDYL1-S467A突变体，表达CDYL1-WT后，AsiSI诱导或VP16诱导的DSBs H3K9cr水平均显著降低；相反，表达CDYL1-S467A突变体不能降低DSBs位点的H3K9cr水平，说明CDYL1通过其crotonyl-CoA水合酶活性在DSB位点抵抗Kcr。CDYL1与HDAC1和HDAC2相互作用，HDACs可以抵抗DNA损伤后的Kcr【8】。因此，作者开始检测H3K9cr 的CDYL1 依赖性减少是否由于 CDYL1 缺失细胞中 DSB 的HDACs招募缺陷。通过ChIP-qPCR，作者发现AsiSI诱导的DSBs处的HDAC1丰度不会因CDYL1缺乏而改变，AsiSI诱导的DSBs的HDAC2招募也与CDYL1无关，表明CDYL1 对于 DSB 位点的 HDAC1/2 积累是可有可无的。

进一步，作者发现组蛋白赖氨酸巴豆酰化的减少与 DSB 诱导的转录沉默相关。CDYL1 crotonyl-CoA水合酶活性对DSB诱导的转录沉默的影响尚不清楚。作者监测了分别与DSB-I和DSB-II位点相邻的MIS12和RBMXL1基因的表达。CDYL1缺失可以缓解 DSB 诱导的 MIS12 和 RBMXL1 沉默。在CDYL1缺失细胞中回补CDYL1-WT可恢复DSB诱导的MIS12和RBMXL1转录沉默，而CDYL1-S467A无效。随后作者检测了全基因组转录活性，结果表明CDYL1 crotonyl-CoA水合酶活性有助于DNA损伤期间的全基因组转录沉默。转录延伸因子ENL是已知的Kcr阅读器（reader），其从染色质中置换会降低RNA Pol II的起始和延伸。因此，作者假设Kcr的CDYL1依赖性下调会触发来自AsiSI诱导的DSB附近的ENL位移，以支撑DSB诱导的沉默。数据显示，CDYL1缺失显著降低了ENL从DSB-I和DSB-II的扩散，进而造成MIS12和RBMXL1基因的ENL水平降低。

最后，作者探究了DSB诱导的转录沉默与DSB修复之间的关系。虽然DSB修复途径的选择是细胞周期调节的，并且CDYL1促进HR修复，然而数据表明DSB处H3K9cr的减少并不会受到细胞周期调节。由于Kcr在转录活性区域富集，表明主动转录基因中的DSBs通过预先存在的转录活性组蛋白标记靶向HR修复。令人惊讶的是，尽管CDYL1-S467A的表达没有恢复DSB诱导的沉默，但它挽救了Cas9诱导的DSB在LMNA基因上的HR缺陷，其程度与CDYL1-WT相似，表明CDYL1 crotonyl-CoA水合酶活性对于DSB诱导的沉默至关重要，但对于HR的完整性则不重要，这说明DSB诱导的沉默不是DSB HR的先决条件。

综上所述，该研究揭示组蛋白巴豆酰化是DSB转录沉默的关键调控因素，并证明DSB诱导的转录沉默与HR在功能上并不是偶联的。在没有DSB的情况下，AsiSI识别位点附近的主动转录基因（图1A）；在表达CDYL1的细胞中，CDYL1被招募到AsiSI诱导的DSB中以抵抗Kcr，驱逐ENL，进而确保DSB诱导的转录沉默和HR（图1B）；在CDYL1缺失细胞中，DSBs位点处的Kcr减少和ENL驱逐受到阻碍，DSB诱导的转录沉默和HR修复发生缺陷（图1C）；在细胞中表达失去巴豆酰辅酶A水合酶活性的CDYL1突变体，CDYL1-S467A可以被招募到DSB位点并促进HR，但它无法抵抗Kcr，驱逐ENL并引发DSB诱导的转录沉默（图1D）。

图1. DSB诱导的转录沉默与HR在功能上是解偶联的

参考文献

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https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.03.031