特别关注｜肝脏驻留自然杀伤细胞在肝细胞癌发生发展中的作用

　　目前，原发性肝癌仍是威胁人类健康的重要癌症，其中肝细胞癌(HCC)约占85%[1]。针对HCC，由于传统治疗手段(如手术切除、肝移植、消融、放化疗等)的局限性，免疫治疗有望成为一种能让更多患者受益的治疗手段[2-3]。然而，当前针对免疫检查点(如PD-1、CTLA-4)的治疗仅在一部分HCC患者中产生持续效应。免疫检查点治疗主要作用于T淋巴细胞，而肝脏作为免疫器官，先天性淋巴细胞(ILC)约占肝淋巴细胞的65%，这些ILC在肝脏抗病原体和抗肿瘤过程中同样发挥着重要作用，可能成为免疫治疗研究的新方向[4-5]。在ILC中，自然杀伤(NK)细胞具有促进肝免疫耐受和抗肿瘤的双重作用[5-6]。最近有研究[7-8]发现，肝脏中存在一种独特的NK细胞亚群，它们以组织驻留的形式常驻于肝脏中且表现出与传统NK(cNK)细胞不同的表型和发育特征，这种NK细胞被称为肝脏驻留NK(LrNK)细胞。随着对LrNK细胞的进一步研究，其功能和作用逐渐明晰。本文重点综述LrNK细胞在HCC研究中的最新进展，并探讨其在HCC免疫治疗中的潜在价值。

　　1LrNK细胞

　　
1.1 小鼠LrNK细胞

　　LrNK细胞最早发现于小鼠肝脏内，当时被称为“凹陷细胞”，后经研究证实，它是驻留在肝窦中具有高度细胞毒性的NK细胞[9]。通过细胞表面标志物CD49a和DX5可将小鼠肝脏NK细胞划分为CD49a+DX5-和CD49a-DX5+两类，前者为LrNK细胞，后者类似于脾脏cNK细胞[10]。两者的发育路径不同，分别由共同辅助样先天淋巴祖细胞和NK祖细胞发育而来，且LrNK细胞中成熟相关表面标志物(如CD11b、Ly49受体、CD43和KLRG1)的表达水平更低[10-11]。小鼠LrNK细胞具有较强的组织驻留特性，只存在于肝窦血液中，而不存在于肝脏的输入和输出血液中[10]。

　　1.2 人LrNK细胞

　　在人肝脏中存在大量从血液转运而来的未成熟CD16-NK细胞，这些NK细胞在肝内可以分化为CD49a+和CXCR6+NK细胞，从而驻留在肝脏[12]。此外，近50%的肝脏NK细胞为CD56+，且都位于肝窦内。肝内CD56+NK细胞表达多种趋化因子受体如CCR5和CXCR6，这些受体与NK细胞的肝脏驻留密切相关。它们能促使NK细胞选择性地向其相应的配体迁移(如CCR5配体CCL3、CCL5，以及CXCR6配体CXCL16)并与之结合使NK细胞驻留于肝组织[5, 13]。研究[5]表明，某些趋化因子(如CCL3、CCL5、CXCL16)选择性存在于肝窦间隙，这有助于表达CCR5和CXCR6的CD56+NK细胞特异性地驻留于肝窦内。与CD56+NK细胞相比，CD56-NK细胞不表达上述趋化因子受体，而表达与循环免疫细胞归巢到周围组织有关的趋化因子受体如CX3CR1，在转录和表型上与外周循环中的NK细胞更相似。

　　然而，CD56和CXCR6的表达都不能准确定义人LrNK细胞的肝脏驻留特性，因为外周组织和血液中也存在CD56+和CXCR6+NK细胞群。目前存在一种共识，即区分人类cNK细胞和LrNK细胞的最好方法是通过转录因子T-bet和Eomes的表达。Eomes高表达T-bet低表达(EomeshiT-betlo)NK细胞约占人类肝脏NK细胞的50%，但完全不存在于血液之中，并且与CD56+和CXCR6+细胞群大部分重叠。尽管如此，人肝脏中的EomeshiNK细胞群体与CD49a+NK细胞群体并不重叠，这表明在人类肝脏中可能存在两种类型的LrNK细胞，其中CD49a+LrNK细胞存在于肝实质，而EomeshiT-betloNK细胞则存在于肝窦内[14]。总之，仍需更多研究发现新的细胞表面标志物去准确定义人LrNK细胞。

　　2LrNK细胞免疫功能

　　
2.1 免疫记忆

　　作为固有免疫系统的重要组成部分，ILC由于缺乏RAG重组酶而不能表达多种抗原受体，因此过去人们认为其不具有适应性免疫功能(即免疫记忆)。但最近的研究[15-16]发现，在特定条件下ILC也能显示出其潜在的记忆功能。Peng等[10]证实了小鼠LrNK细胞能够在半抗原的刺激下介导接触性超敏反应并产生记忆应答，当机体再次接触相同半抗原时能增强NK细胞杀伤作用。

　　芳烃受体(Ahr)是一种受外源性和内源性配体调节的转录因子，对屏障部位免疫细胞的稳态起着重要作用。在小鼠肝脏中，LrNK细胞稳定表达Ahr，且Ahr能维持LrNK细胞的半抗原记忆功能[17]。此外，人类CD49a+LrNK细胞能够表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)和NKG2C，且在体外培养长期扩增后仍能保持原有表型，这都说明人类LrNK细胞也可能具有适应性免疫功能[18]。然而，LrNK细胞成熟相关表面标志物的表达水平较低，说明其相对于cNK细胞来说较不成熟，这种幼稚性并不利于免疫记忆。因此，LrNK细胞的免疫记忆功能还有待进一步研究。

　　2.2 免疫调节

　　肝脏不同部位的LrNK细胞在免疫调节功能上有所不同。人肝实质中的CD49a+LrNK表达MHC-Ⅰ类受体和细胞毒性效应分子，这可能与识别并杀死病毒感染或癌变的肝细胞有关；而存在于肝血窦中的EomeshiLrNK则较少表达MHC受体，它们可能更多地识别来源于肠道的细菌及其产物，并产生杀伤作用[14]。此外，与血液中的NK细胞相比，EmosehiLrNK细胞表面刺激性受体(NKp44、NKp46和NKG2D)表达增加，细胞毒性作用增强但产生促炎症细胞因子(如IFNγ)的能力降低[13]。这表明LrNK细胞也许能在保留免疫监视功能的前提下削弱自身促炎症作用对组织的病理损伤。有研究[19-21]发现，LrNK细胞与T淋巴细胞之间存在着相互调节的作用。一方面，CD8+T淋巴细胞通过CD70/CD27信号促进未成熟的CD27+LrNK细胞向成熟的CD27LrNK细胞转化；另一方面，LrNK细胞可以通过免疫抑制信号PD-1/PD-L1来削弱肝内T淋巴细胞的抗病毒作用。还有研究[22]报道，小鼠LrNK细胞中的DX5-CD11chi亚型能够通过抑制CD4+T淋巴细胞的增殖从而抑制自身免疫性胆管炎的进展，并且这种抑制作用在炎症环境下尤为明显。目前，对LrNK细胞免疫调节功能的认识尚不深入，还需更多研究去阐明其免疫调节作用的内在机制。

　　3LrNK细胞与HCC的发生发展

　　
3.1 LrNK细胞与肝炎、肝纤维化以及肝硬化

　　肝炎、肝纤维化以及肝硬化是HCC发生发展过程中的重要环节，LrNK细胞在这些肝脏疾病中均发挥一定作用[23]。病毒性肝炎初期，NK细胞能够直接识别并清除病毒感染的肝细胞，但CD8+T淋巴细胞仍是发挥抗病毒作用的主要免疫细胞[24-25]。Zheng等[25]通过建立小鼠HBV肝炎模型，发现cNK细胞能够通过产生IFNγ诱导CD8+T淋巴细胞的活化，从而间接发挥抗HBV的作用，但LrNK细胞却不存在上述调节作用。另有研究[26-27]表明，在病毒性肝炎进展中，尽管LrNK细胞表面激活性受体NKp46和NKG2D表达有所上调，但肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的表达下调以及脱颗粒能力的减弱, 最终导致LrNK细胞的细胞毒性受损。在肝纤维化过程中，γδT细胞能通过CD137/CD137L信号促进LrNK细胞的活化并上调其表面细胞毒性效应分子(如穿孔素)。活化的LrNK细胞能够诱导肝星状细胞(HSC)凋亡，并且有效杀伤活化的HSC，从而抑制肝纤维化的进程[28]。然而，在肝纤维化进展为肝硬化的过程中，LrNK细胞中NKp46和穿孔素的表达均减少，其对HSC的杀伤作用也明显减弱[29-31]。LrNK细胞在不同肝脏状态下的功能改变如图 1所示。

　　图1 LrNK细胞在不同肝脏状态下的功能改变

　　注：a，在正常肝脏中，LrNK细胞高表达NKp44、NKp46和NKG2D，低表达IFNγ[13]；b，在病毒性肝炎中，LrNK细胞NKp46和NKG2D表达水平升高，但其TRAIL的表达以及脱颗粒能力减弱[26-27]；c，在肝纤维化和肝硬化中，LrNK细胞NKp46、CD161的表达及穿孔素的分泌减少，且对HSC的杀伤活性受到抑制[29-31]；d，在HCC中，LrNK细胞免疫检查点(TIM-3、LAG-3、TIGIT)表达上调，且抗肿瘤活性(NKG2D、TRAIL、FASL)受到抑制[32-34]。

　　3.2 LrNK细胞在HCC进展中的作用

　　NK细胞具有很好的抗HCC活性，但在HCC的进展过程中，NK细胞的数量及细胞毒性发生了改变。不同分期HCC患者的肝内NK细胞数量均有所减少，且这种减少在晚期(Ⅱ期和Ⅲ期)HCC患者中尤其显著[35]。此外，与早期(Ⅰ期)HCC患者相比，晚期HCC患者肝内NK细胞分泌颗粒酶B和穿孔素的能力明显下降，细胞毒性严重受损[35]。这说明随着HCC的进展，肝内NK细胞的数量下降、功能受损，最终导致肿瘤的免疫逃逸。与之相似，LrNK细胞在HCC进展中的不同时期也发挥着不同的作用。早期HCC中，LrNK细胞通过NKG2D、TRAIL和FASL等表面受体能够有效清除癌变的肝细胞，维持正常肝脏微环境的稳态[34]。然而，随着HCC的进展，逐渐形成的HCC微环境影响了LrNK细胞的抗肿瘤活性。例如，在乳酸富集的HCC微环境中，LrNK细胞内乳酸水平升高，由于自身NKp46、CD107a和颗粒酶B表达下调或线粒体诱导的细胞凋亡而失活[36]；IFNγ能够增强造血前体细胞的增殖促进LrNK细胞的发育，但HCC微环境中IFNγ水平明显下降，这可能通过减少LrNK细胞的数量削弱其抗肿瘤作用[20-21, 37]。

　　免疫检查点作用机制是肿瘤进展的重要原因之一。T淋巴细胞表面的免疫检查点(如PD-1、CTLA-4)能通过抑制其肿瘤杀伤活性而促进HCC细胞的免疫逃逸，且HCC微环境中的T淋巴细胞高表达免疫检查点分子是晚期HCC的一个重要特征[38]。在HCC进展过程中，肿瘤浸润性LrNK细胞表面免疫检查点T淋巴细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域蛋白3(TIM-3)的表达明显上调。TIM-3与HCC组织中的磷脂酰丝氨酸相互作用后发生磷酸化，磷酸化的TIM-3与PI3K的p110亚基竞争结合p85，随后抑制下游的Akt/mTORC1信号，导致LrNK细胞分泌细胞因子减少、细胞毒性作用减弱[39]。最新的研究[33, 39]表明，除了TIM-3外，HCC组织内的LrNK细胞还高表达PD-1、LAG-3、TIGIT等免疫检查点分子，且瘤内表达免疫检查点LrNK细胞所占比例越高的患者更容易出现癌栓和无肿瘤包膜，总生存期和无病生存期也较短。总之，在HCC微环境的影响下，晚期HCC组织中的LrNK细胞免疫检查点分子表达上调，免疫功能受损，且可能导致患者预后不良。这说明针对LrNK细胞的免疫治疗可能对晚期HCC患者有益，但仍需更多研究进一步阐明免疫检查点在LrNK细胞中的作用机制及相关免疫治疗的可行性。

　　4小结与展望

　　目前，对于小鼠LrNK细胞的定义较为明确，而人LrNK细胞的定义则主要靠细胞表面标志物(如CD49、CD96、CXCR6)和转录因子(如Eomes、T-bet)，且存在一定的争议。如今公认的人LrNK细胞表型主要包括CD56+CD49a+CD69+CD103+CXCR6-和CD56+EomeshiCD69+CD103-CXCR6+，但也有报道[40-41]称CD56+CD49e-CD69+CXCR6+NK细胞具有肝脏驻留特性。LrNK细胞可能具有记忆功能且能发挥较强的细胞杀伤作用，这对于机体的抗肿瘤免疫具有十分重要的意义。在HCC的发生发展过程中，LrNK细胞受到HCC环境中多种因素的影响而功能受损，同时通过上调相关免疫检查点的表达促进HCC的免疫逃逸。综上所述，LrNK细胞作为新近发现的组织驻留性NK细胞，有望成为HCC免疫治疗的新靶点，但其发挥免疫作用的机制仍需要进一步探索。

　　引证本文

　　王俊旗, 徐锋. 肝脏驻留自然杀伤细胞在肝细胞癌发生发展中的作用[J]. 临床肝胆病杂志, 2022, 38(2): 457-460.