应用于生物治疗的螺旋藻，用于组成和高效表达蛋白质药物

撰文 | Enigma

随着基因工程的发展，现代生物技术已经实现将细胞驯化为生物工厂。常用的表达平台包括用于制造相对小而简单的治疗性蛋白的大肠杆菌，以及用于制造更复杂分子的酵母和哺乳动物细胞。决定是否采用新的表达平台，取决于是否有方法对该生物体进行基因改造，以实现外源蛋白的稳定高效的表达，同时也取决于该生物体是否具有与大规模生产和商业化相适应的生物学特性。转基因植物具有与培养细胞不同的性质特征，比如光合生长和易于扩大规模。然而，由于基因方法繁琐、生长速度慢、产率低以及监管约束等因素，转基因植物的潜力并未实现。藻类被视为生物技术应用中植物的替代品，但藻类难以进行基因改造，外源蛋白的表达水平低且经常不稳定。到目前为止，还没有利用藻类平台进行商业化的生物治疗方法。

光合作用的螺旋藻是世界上唯一一种作为食物进行商业养殖的微生物，它的蛋白质含量超过了所有其它粮食作物，因此成为高水平表达治疗性蛋白质的有力候选者。螺旋藻的无性繁殖降低了基因逃逸到食物链的风险，以及相关的食品安全和监管问题。因此，螺旋藻有望展示出植物在生物制药中的优势，可能克服其它基于作物或藻类平台的挑战和限制。

2022年3月21日，美国Lumen生物科技公司的James Roberts等在Nature Biotechnology上发表了题为Development of spirulina for the manufacture and oral delivery of protein therapeutics的研究论文。他们提出了针对螺旋藻的基因工程方法，包括采用无标记的同源重组将外源基因整合到螺旋藻染色体中，以及稳定、高水平表达治疗性蛋白，包括生物活性肽、单链抗体、酶、信号蛋白和疫苗抗原。作者介绍了在动态药品生产质量管理规范（cGMP）下，采用螺旋藻大规模制药的室内栽培技术的发展，并进一步报道了一种可食用的、针对空肠弯曲杆菌胃肠道感染的抗体药物的开发，以说明螺旋藻平台在满足迫切的医学需求上的应用，包括在弯曲菌病动物模型中的验证，以及在人体临床一期试验中展示的安全性和药代动力学。

作者研究发现，尽管被认为难以进行基因改造，但螺旋藻其实天生就具有转化的能力。他们将螺旋藻（UTEX LB1926 and NIES-39）在液体培养基中与融合载体共孵育，其中载体上包括一个可选择的标记和一段目的基因，两侧有与螺旋藻染色体同源的序列。通过同源重组过程，转化DNA进行了靶向整合，通过插入位点两侧的引物对染色体DNA进行测序发现，这种转化方法产生了约100个独立转化子。在连续选择的条件下，多倍体螺旋藻在转化8-10周后发生纯合性分离，此后转基因在遗传上表达稳定。9株连续繁殖1年以上的菌株全部未发现转基因序列变化，甚至有2株连续繁殖3年以上（>800代细胞）未发生变化。值得注意的是，只有与微生物共培养时，螺旋藻才表现出转化的感受态。因此作者采用异生株进行基因转化，而采用无菌株进行蛋白生产。

通过用外源链霉素抗性基因（aadA）取代螺旋藻的一段KmR基因，再用串联的KmR基因和目的基因取代addA即能开发出一种无标记的基因工程方法对螺旋藻进行改造。改造株的目的基因整合在KmR基因一侧，并无其它外源基因。作者采用多种外源DNA载体引入螺旋藻基因组，包括单基因、串联基因、操纵子等。最大的转化DNA盒达到6.0 kb，包含一个7基因的c-藻蓝蛋白操纵子。多种不同外源蛋白，包括生物活性肽、抗原结合域等可在胞内稳定表达，其中，使用来自c-藻蓝蛋白位点（Pcpc600）的强启动子表达的蛋白累计占总可溶性蛋白的29%。

作者采用改造的螺旋藻（SP526）表达了可用于弯曲杆菌疾病预防的抗体药物，并在小鼠模型中对口服药物的预防效果进行了验证，发现SP526治疗可减少排便中的弯曲菌至3到4个数量级，并显著减少肠道炎症的两个生物标志物——脂蛋白2（LCN-2）和髓过氧化物酶（MPO）。在对照组中全部小鼠出现腹泻，而在口服SP526的小鼠中没有出现腹泻现象。剂量范围实验表明，口服2 mg的干SP526可预防弯曲杆菌病。这加速了攻毒24小时后弯曲菌从肠道的排出，并减少了72小时后弯曲菌的排出。

为了实验大规模可持续生产，作者开发了模块化的、室内的、160-2000升的垂直平板光生物反应器，在反应器中可以控制pH值和空气混合。通过增加反应器数量而不是体积可实现商业规模的制造。在生长后，用海藻糖溶液漂洗螺旋藻浆，并进行喷雾干燥。通过优化干燥效率、湿度和抗体活性保留上的参数设计，实现超过90%的抗体活性保留。干燥粉末收集后密封在防光防潮的包装中，抗体活性在42°C保持至少6个月。最后将粉末封装在素食胶囊中。产品生产过程均严格遵守cGMP。作者发现，当采用螺旋藻递送抗体药物时，超过70%的药物可在模拟胃环境中孵育两小时后仍保持完整，这表明螺旋藻包覆可为药物提供保护。而在模拟十二指肠的更高pH环境中，超过90%的药物可在60分钟内从螺旋藻中释放。此外，首个人体临床安全试验也取得了良好的效果。

该研究发现螺旋藻可用于组成和高效表达蛋白质药物，其生产能力和药效十倍甚至百倍于其它食品平台的效果，为口服蛋白药物的生产提供了新的有力工具。

https://doi.org/10.1038/s41587-022-01249-7

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