靶向细胞消除新方法：NTR 2.0

撰文 | 十一月

细胞消除（Cell ablation）的方法有很多，比如遗传方法、激光以及药物等。细菌中硝化还原酶NTR（Nitroreductase）的转基因表达使得真核细胞对甲硝唑（Metronidazole，MTZ）等前药物敏感，从而能够选择性的进行细胞消除，进而能够帮助进行脊椎动物细胞功能以及再生等方面进行研究。但是第一代NTRs所需要前药物浓度很高，且部分细胞对药物处理具有明显的抵抗性。

2022年2月7日，美国约翰霍普金斯大学Jeff S. Mumm研究组与新西兰惠灵顿维多利亚大学David F. Ackerley  研究组合作在Nature Methods上发表文章NTR 2.0: a rationally engineered prodrug-converting enzyme with substantially enhanced efficacy for targeted cell ablation，利用前药物转化酶构建了新版本细胞消除方法NTR 2.0，可以以更高效率、更高准确性进行细胞消除。

NTR能够产生迅速的杀死宿主细胞的基因毒性产物，因此可以用于抗癌以及抗生素药物的开发【1】。NTR结合前药物CB1954的转基因在脊椎动物的表达成为靶向细胞消除的策略之一【2-3】。但是由于前药物CB1954会产生细胞渗透性细胞毒素，杀死附近的非靶标细胞，损害了其用于选择性细胞消除的特异性。相比之下，前药物甲硝唑可以消除NTR表达的细胞，但是不影响周围的细胞。该系统可以应用于斑马鱼之中对细胞再生的研究，同时可以利用荧光报告基因对体内的细胞进行可视化和量化。但是NTR 1.0中催化效率很低，需要高浓度的甲硝唑才能有效进行细胞消除，而高浓度的甲硝唑暴露超过24小时后则会造成毒性，而且比如巨噬细胞以及多巴胺能神经元会对NTR 1.0版本的细胞消除方法产生耐药性。

为了解决现有的这些限制，作者们采用了一个级联筛选途径，通过靶向诱变以及高通量选择，希望对NTR的性能进行优化。首先作者们发现了一个NTR 1.0的三重突变体可以与前药物CB1954结合将其活性提高到40-80倍，作者们将其称为NTR 1.1，但是该突变体对于前药物甲硝唑结合活性的改善则很少。进一步的，通过生物工程以及跨物种的比较和测试，作者们从创伤弧菌中设计了一种NTR的同源物，可以将甲硝唑结合介导的细胞消除效率提高100倍左右，也就是说只要在100 uM左右甲硝唑的条件下就可以达到以前NTR 1.0版本10 mM甲硝唑处理后的靶向细胞消除效果（图1）。因此，作者们将该同源物所构建的定向细胞消除系统称为NTR 2.0。

图1 系统性诱变提高NTR活性

在构建好这一系统后，作者们对NTR 2.0在不同体系中的工作效率进行检测。首先，作者们在哺乳动物细胞系HEK-293中对细胞使用MTS细胞存活系统对NTR 2.0进行评估，可以发现NTR 2.0的细胞消除效率以及特异性均高于最初版本以及1.1版本。进一步的，作者们在脊椎动物斑马鱼中对NTR 2.0的效率进行检测，NTR 2.0的细胞消除效率比NTR 1.0改善了约100倍，比NTR 1.1提高约33倍。通过对NTR 2.0特异性检测，在斑马鱼视网膜细胞中，40 uM甲硝唑48小时处理后在NTR 1.0系统几乎没有反应情况下，可以完全消除失斑马鱼视网膜中的视杆细胞（图2）。通过系统性检测，作者们确认NTR 1.0半最大效应浓度为540 uM，而NTR 2.0半最大效应浓度只有3 uM。

图2 NTR 2.0细胞消除特异性以及甲硝唑浓度依赖特性

除了能够以低浓度甲硝唑从而能够延长对少年期斑马鱼的处理，同时作者们也发现NTR 2.0系统能够有效应用于成年斑马鱼体内达到靶标细胞细胞消除的效果。另外，先前对NTR 1.0具有抗性的巨噬细胞等类型，也能够顺利利用NTR 2.0系统进行细胞消除。除此之外，作者们通过UAS-Gal4以及QUAS-QF系统可以实现双系统控制NTR 2.0的表达，作者们构建了多种可用的斑马鱼品系以及载体，可以在质粒网站（https://www.addgene.org/）以及斑马鱼网站（Zebrafish International Resource Center，ZIRC; https://zebrafish.org/home/guide.php）上获取。

总的来说，该工作通过生物工程以及系统性筛选发现了灵敏度更高、特异性更好的靶向细胞消除系统NTR 2.0，为细胞定向消除、细胞功能研究以及再生过程的探索提供了新的平台与工具。新工具总是如雨后春笋般冒出来，然后将前浪打在沙滩上。这是领域具有生命力递增接力，就像是在奥运赛场上尝试4A动作的羽生结弦，“守一座守不住的城， 打一场打不赢的仗......把自己所有的荣耀、所有的辉煌，放在历史的车轮之下。”你要问我哪一个版本是最好的，那我会告诉你是下一个。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41592-021-01364-4

制版人：十一

参考文献

1. Lewis, K. Platforms for antibiotic discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 12, 371–387 (2013).

2. Drabek, D., Guy, J., Craig, R. & Grosveld, F. The expression of bacterial nitroreductase in transgenic mice results in specific cell killing by the prodrug CB1954. Gene Ther. 4, 93–100 (1997)

3. Clark, A. J. et al. Selective cell ablation in transgenic mice expression E. coli nitroreductase. Gene Ther. 4, 101–110 (1997).

4. Medico, E., Gambarotta, G., Gentile, A., Comoglio, P. M. & Soriano, P. A gene trap vector system for identifying transcriptionally responsive genes. Nat. Biotechnol. 19, 579–582 (2001)

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