FSHW | 以菌制菌—格氏乳杆菌新分离株HMV18对病原细菌生长的抑制作用

Introduction

以菌制菌的策略在中国古代早有应用，随着细菌培养、分离和鉴定技术的提高，不断发现益生菌具有多种对人体有益的作用，特别是在抑制病原性细菌方面作用显著。人体共生着种类众多的益生菌，与人体互惠互利。格氏乳杆菌在人体分布广泛，比如口腔、肠道、女性阴道和母乳都能分离到。格氏乳杆菌自身是兼性厌氧性细菌，在帮助制造肠道厌氧微环境起重要作用。有学者认为它可能作为第一批在肠道定植的细菌，来辅助双歧杆菌这种专性厌氧性细菌的定植和生存。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和克雷伯菌是肠道致病菌，经常通过粪口途径污染食物和水源，导致人类疾病。这些致病性细菌还经常携带耐药基因，产生耐药性，对抗生素治疗不敏感，导致治疗成本增加，副反应也随之而来。乳杆菌作为食品添加剂具有抑制致病菌的作用。乳杆菌抑制致病菌的种类也比较广泛，大都是革兰氏阳性菌，少部分是革兰氏阴性菌，这与乳杆菌产生的细菌素作用范围广可能有关。从人体中的酸性环境分离到能拮抗病原菌的乳杆菌的机会大大增加。

河北医科大学基础医学院高翔博士、贾娴娴副教授，法医学院丛斌院士和河北省食品检验研究院张岩研究员等 在本文中描述了一株格氏乳杆菌新分离株HMV18的分离鉴定、生物学特性、抑菌特性、溶血性、耐药性和小鼠灌服活菌后，回肠组织和血清炎症因子的变化。

Results and Discussion

格氏乳杆菌HMV18的分离鉴定和生物学特性

格氏乳杆菌HMV18在MRS固体培养基上生长为圆形的灰白色的菌落（图1A），革兰染色阳性（图1B），细菌细胞在液体培养基中为直径0.5～0.7 µm的圆形（图1C1），在固体培养基为0.5～0.7 µm宽，2～2.5 µm长的杆形（图1C2）。无鞭毛，无菌毛，无芽胞。

当以105 CFU/mL为接种的起始量，记录格氏乳杆菌HMV18在30 h内的生长曲线，发现分为3个典型的阶段，即迟缓期、指数生长期和平台期。在后两个阶段培养液的pH显著降低（图1D）。

经16 S rDNA测序鉴定（图2）和进化树分析（图3），确认格氏乳杆菌HMV18为新分离株，与NCBI Blast数据库已有格氏乳杆菌亲缘关系较远。

图1 格氏乳杆菌HMV18的生物学特性

图2 格氏乳杆菌HMV18的16S rDNA

图3 格氏乳杆菌HMV18的进化树分析

格氏乳杆菌HMV18的抑菌特性

文章采用牛津杯法检测格氏乳杆菌HMV18无菌培养上清对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和克雷伯菌的抑制作用。图4显示格氏乳杆菌HMV18无菌培养上清对三种致病菌都具有抑制效果，抑菌圈直径分别为21、16和18 mm。

图4 格氏乳杆菌HMV18的无细胞上清液的抑制作用

格氏乳杆菌HMV18的溶血性和耐药性

格氏乳杆菌HMV18在血平板上呈现α-溶血（图5A），提示可能具有条件致病的风险，还需要体内实验的确认。由于该菌不表现β-溶血，不考虑其具有强致病性。表1显示该菌对30种抗生素的敏感性，S表示敏感，R表示耐药。结果发现，格氏乳杆菌HMV18对头孢曲松、青霉素、氯霉素、四环素、红霉素等常见抗生素敏感，提示，如果出现该菌引起的偶发感染，可用敏感抗生素进行治疗。表2显示该菌染色体上可能与耐药性有关的基因，类似的基因在该菌携带的质粒和噬菌体上并没有发现，说明该菌存在其他细菌水平转移耐药基因的可能性很小，这对评价该菌作为食品添加剂的安全性有积极意义。

图5 格氏乳杆菌HMV18的安全性评价

表1 抗生素敏感性实验结果

表2 格氏乳杆菌HMV18抗性基因注释

格氏乳杆菌HMV18灌胃小鼠回肠组织和血清炎症因子的变化

灌胃活菌的小鼠回肠组织与灌胃PBS对照组类似，黏膜、微绒毛、腺腔和隐窝均保持完整，并未出现炎性浸润（图5B）。血清中指示炎症的因子比如IFN-γ和IL-4并未出现显著变化，而指示抑制炎症的因子IL-10显著增加（图5C），提示格氏乳杆菌HMV18可能存在调节免疫的潜力，不会促进炎症反应反而抑制炎症反应，缓解过敏方面可能具有应用价值。

Conclusion

HMV18经鉴定为格氏乳杆菌新分离株。该菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和克雷伯菌具有明显的抑制作用。该菌产生 α-溶血，可能为条件致病菌，由于对多种常见抗生素敏感，如果发生偶发感染事件，可用敏感抗生素治疗。该菌不具有可水平转移的耐药基因。经口灌胃活菌的小鼠回肠组织没有明显的炎症反应，也没有刺激血清中出现促炎症的细胞因子。以上结果说明，格氏乳杆菌新分离株HMV18有潜力成为食品或药品的添加菌种来防治由大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和克雷伯菌引起的食源性疾病。

第一作者简介

高翔，女，理学博士，现为河北医科大学基础医学院讲师，主要研究方向为益生菌与病原微生物的相互作用机制；益生菌的工程化改造及其应用；人体菌群与微环境的相互关系和免疫调节。目前主持河北省重点研发计划1项，参加国家自然科学基金、河北省自然科学基金项目等多项，在国内外期刊公开发表学术论文10余篇，其中SCI收录9篇，第一或共一作者论文2篇，授权国家发明专利1件。

通信作者简介

贾娴娴，女，医学博士，现为河北医科大学基础医学院副教授，硕士生导师，主要研究方向为人体微生态与免疫调控。在国内外期刊公开发表论文14篇，其中SCI论文10篇，授权发明专利2项。主持科研及教学课题10余项。

丛斌，男，中国工程院院士，何梁何利奖获得者，教授、主任法医师、医学博士。河北医科大学法医学及病理生理学、四川大学和南方医科大学（校外）法医学、中国医学科学院北京协和医学院（院外研发机构）病原生物学博士生导师。中国医学科学院学部委员，中国中医科学院学部委员，中国中西医结合学会副会长，中国药典委员会执行委员，国家环保部环境损害鉴定评估专家委员会主任委员，国家食品药品监督管理总局特殊医学用途配方食品和特殊膳食食品抽检监测牵头分析专家委员会主任委员，Food Science and Human Wellness总编。获国家科技进步一等奖1项、二等奖2项，省部级科技进步一等奖3项、省自然科学二等奖2项、三等奖1项；主持科研课题48项，其中国家自然基金10项（含重点项目2项）、国家科技支撑计划重点项目2项；发表学术论文480余篇，其中SCI收录136篇，单篇最高影响因子40.197。主编《实用法医学》（480万字，科学出版社）、《中华大百科全书》、《法医病理学》等专著和国家统编教材10部，获授权发明专利11项。

张岩，男，博士，博士生导师，河北省食品检验研究院副院长，河北省食品安全重点实验室主任，国务院政府特殊津贴专家；国际标准化组织生物技术委员会生物方法工作组专家，第二届食品安全国家标准审评委员会委员，全国生化检测标准化技术委员会委员，全国生物芯片标准化技术委员会委员；Food Science and Human Wellness副主编，Journal of Future Foods编委，Journal of Food Quality编委，《食品科学》编委，《肉类研究》编委，《乳业科学与技术》编委；入选“河北省三三三人才工程”一层次，“河北省青年拔尖人才”（首批），“河北省青年科技奖”获得者。牵头研究的项目成果共获得省部级科技进步奖多项。主要从事天然植物功效因子检测识别技术、功效评价技术、食品污染物分析技术、风险评估技术及相关标准制修订研究。发表SCI论文60篇，其中IF5.0以上的18篇；授权发明专利9项，参编出版专著21部。

A new Lactobacillus gasseri strain HMV18 inhibits the growth of pathogenic bacteria

Xiang Gaoa,b,1, Zixuan Wanga,1, Xiang Lic,1, Xiaoling Zhangd, Shengqiang Duc, Miaomiao Jiab,c, Dailun Hua, Xianxian Jiaa,b,*, Bin Congb,f,*, Yan Zhangb,e,f,*, Chunling Mab,f, Song Zhoud, Jun Zhangc

a Department of Pathogen Biology, Institute of Basic Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China

b Research Unit of Digestive Tract Microecosystem Pharmacology and Toxicology, Chinese Academy of Medical Sciences, Shijiazhuang 050017, China

c Institute of Basic Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China

d Shijiazhuang Great Wall Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital, Shijiazhuang 050035, China

e Hebei Food Safety Key Laboratory, Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050227, China

f College of Forensic Medicine, Hebei Key Laboratory of Forensic Medicine, Collaborative Innovation Center of Forensic Medical Molecular Identification, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China

1These authors contributed equally to this work.

*Corresponding authors.

E-mail address: hbydjiaxianxian@126.com

hbydbincong@126.com

snowwinglv@126.com

Abstract

To search for a new eco-friendly therapy for infectious disease caused by Escherichia coli, Staphylococcus aureus or Klebsiella oxytoca, we collected the vaginal swabs from healthy women, screened for Lactobacillus and found a strain repressing the growth of pathogenic bacteria. The new isolate was identified as L. gasseri by the colony morphology, Gram staining, biochemical reactions and confirmed by the 16S rDNA sequencing. The HMV18 strain inhibited the growth of food-borne pathogens such as E. coli, S. aureus and K. oxytoca. The HMV18 strain was sensitive to penicillin, ampicillin, erythromycin, tetracycline and chloramphenicol. The HMV18 strain produced α-hemolysis. Pathological histology of the mice ileum showed that the mucosa, villi, lamina propria and crypt depth remained intact and there was no inflammation or hyperemia in the L. gasseri HMV18 gavaged group. L. gasseri HMV18 could not up-regulate inflammatory cytokines level of plasma. All the results suggested L. gasseri HMV18 is a candidate probiotic to be an additive for food preservation or drug to prevent food-borne diseases.

Reference:

GAO X, WANG Z X, LI X, et al. A new Lactobacillus gasseri strain HMV18 inhibits the growth of pathogenic bacteria[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(2): 247-254. DOI:10.1016/j.fshw.2021.11.010.

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于2022年5月7-8日在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。