CRM197，即白喉毒素无毒突变蛋白，一个陌生的名字，但事实上，CRM197是一种广泛应用于疫苗研发领域的载体，问世数十年来，已保护数千万儿童免受多种疾病的侵害。
CRM197到底是什么？它又从何而来？本期专题将为大家详细介绍CRM197的历史。
CRM197蛋白结构图
白喉毒素——强力的细菌毒素
要 了 解C RM197的历史，必须得从它的“前辈”——白喉毒素讲起。 早在1888年，科学家Roux和Yersin就发现由白喉杆菌分泌的白喉毒素是白喉病的元凶。 白喉毒素是一种强力的细菌毒素，仅仅40ng（纳克，1纳克=1/1000微克）白喉毒素就能让一只250g的豚鼠死亡。 当人体感染白喉杆菌时，白喉毒素会破坏细胞，把渗出的纤维素、白细胞及坏死组织凝固成一坨灰白色假膜。 荚膜的脱落加上咽喉、气管黏膜水肿，会引起呼吸道阻塞，甚至造成窒息死亡。 白喉毒素进入血液后可与心肌、肝细胞或外周神经细胞等结合，引起内脏出血和神经麻痹，损害极大。
最初的胜利——白喉类毒素的发现
为了预防和治疗白喉（一种由白喉杆菌所引起的急性呼吸道传 染 病），疫苗的研发迫在眉睫。 1928年，科学家发现白喉毒素经甲醛脱毒处理形成的白喉类毒素（diphtheria toxoid）保留了很好的免疫原性，是疫苗的不二选择。 经过科学家们的不懈努力，白喉类毒素作为疫苗抗原在临床大规模使用。 1953年，人类几乎宣告了对抗白喉的胜利。 在此之后，白喉类毒素被开发为载体蛋白，可以搭载其他小分子，如多糖、寡糖、多肽等物质，从而为研发预防多种传染病的结合疫苗铺平了道路。
然而，白喉类毒素通常由数千种不同的物质组成，需要经过脱毒方可使用。白喉类毒素在甲醛处理前纯度可达90%以上，而脱毒后的纯度只有60%-70%。在稀释和去除过量甲醛后，白喉类毒素会再次产生毒性，因此，在解毒过程中要加入赖氨酸，防止毒性的再次产生。然而，经过化学处理的白喉毒素会失去其天然结构，并可能会丢失一些T细胞和B细胞表位。除上述弊端之外，甲醛脱毒可能会有残留，作为疫苗使用尤其是婴幼儿免疫接种，存在一定风险。
大自然的馈赠还是天才的汗水——CRM197
为避免白喉类毒素的诸多缺点，开发更为安全有效的疫苗，在重组DNA技术发展之前的1971年，哈佛大学的Uchida教授及同事就开始分离各种无毒或部分有毒的白喉毒素。他们在经历了几百次实验失败后，终于分离出五种始终呈阴性反应的菌株，这五种菌株经鉴定为交叉反应材料，即CRM，分别为：CRM30、CRM45、CRM176、CRM197和CRM228。
在这五个兄弟姐妹中，CRM30和CRM45的分子量太小缺少结构域；CRM176和CRM228的分子量与野生型毒素相似，但结合和酶活性降低，表明存在不止一种突变；CRM197虽然显示酶活性丧失，但保留结合活性，与野生型毒素相比变化最小，所以它脱颖而出，被选为最适合进行疫苗开发的。
随后的遗传分析表明，CRM197中的突变是由于酶活性结构域（片段A）中的单个氨基酸替代（第52位甘氨酸Gly突变为谷氨酸Glu）。
CRM197蛋白GLU52突变位点
而CRM197完全无毒，即便用3 mg（毫克）的超大量注射，也未能在5天内杀死体重为250 g的豚鼠。
由于CRM197无毒，不需要甲醛解毒，安全性得到了保障；并且它可以直接从培养物上清液中纯化，纯度高达90%；此外T辅助表位可能得到更好的保存，因而CRM197比白喉类毒素具有更好的载体效应。
1990年，第一个以CRM197为载体蛋白的结合疫苗诞生（ HibTITER® ，美国惠氏），在6000名接种儿童中表现出良好的耐受性和免疫原性，并且可使18个月以下婴儿的Hib（b型流感嗜血杆菌）疾病减少94%。对240,000名接种HbOC的美国儿童的进一步监测发现，在4年零8个月的时间里，0-8岁儿童的Hib相关疾病几乎被消除。与之前获得许可的与白喉类毒素偶联的Hib疫苗（PRP-D；ProHIBIT®，康诺特实验室）相比，HbOC在6个月以下的儿童中表现出优越的免疫原性。
随后的三十年来，越来越多的 结合疫苗，尤其是婴幼儿疫苗，开始使用CRM197作为载体蛋白，如已经在全球普遍使用的有Hib疫苗（Vaxem- Hib®，瑞士诺华疫苗）、7价和13价肺炎球菌疫苗（Prev(e)nar™和Prev(e)nar 13™，美国惠氏）和脑膜炎球菌血清群C结合疫苗（Menjugate®，瑞士诺华疫苗； Meningitec®，美国惠氏）。
针对A、 C、W-135和Y型脑膜炎球菌血清群的四价脑膜炎球菌结合疫苗（Menveo®，瑞士诺华疫苗）也已获准在美国、欧洲、加拿大和其他地方使用。 此外，还有基于CRM197的五价（白喉、破伤风、百日咳、乙型肝炎和 Hib）疫苗（Quinvaxem®，瑞士诺华疫苗）和四价白喉、破伤风、百日咳、Hib疫苗（Quattvaxem®，瑞士诺华疫苗）。 其他使用CRM197作为蛋白质载体的结合疫苗正在开发中，包括15价肺炎球菌疫苗、B组链球菌疫苗、念珠菌疫苗和沙门氏菌疫苗等。
经历了四十多年发展的CRM197，正在从免疫载体新星变为中流砥柱。除了用作细菌疫苗载体，CRM197还有更多的用武之地。欲知后事如何，且看下期专题：CRM197载体蛋白的应用领域和前景。
参考文献
1. Uchida, T.; Gill, D. M.; Pappenheimer, A. M., Jr., Mutation in the structural gene for diphtheria toxin carried by temperate phage. Nat New Biol 1971, 233 (35), 8-11.
2. Uchida, T.; Pappenheimer, A. M., Jr.; Harper, A. A., Reconstitution of diphtheria toxin from two nontoxic cross-reacting mutant proteins. Science 1972, 175 (4024), 901-3.
3. Pappenheimer, A. M., Jr.; Gill, D. M., Diphtheria. Science 1973, 182 (4110), 353-8.
4. Uchida, T.; Pappenheimer, A. M., Jr.; Greany, R., Diphtheria toxin and related proteins. I. Isolation and properties of mutant proteins serologically related to diphtheria toxin. J Biol Chem 1973, 248 (11), 3838-44.
5. Shinefield, H. R., Overview of the development and current use of CRM(197) conjugate vaccines for pediatric use. Vaccine 2010, 28 (27), 4335-9.
6. Broker, M.; Costantino, P.; DeTora, L.; McIntosh, E. D.; Rappuoli, R., Biochemical and biological characteristics of cross-reacting material 197 CRM197, a non-toxic mutant of diphtheria toxin: use as a conjugation protein in vaccines and other potential clinical applications. Biologicals 2011, 39 (4), 195-204.
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