诺奖得主撤稿风波后，中国学者再次发起挑战！改造酶催化非天然化学反应，登上Science！

自然界中的各种酶是组成生命系统的核心关键成分。它们在适宜的温度下能够发挥对各项生命活动来说至关重要的各种生物化学反应。然而酶极高的专一性和特异性导致它们仅能识别和催化特定的客体和反应。为了将酶的催化能力运用到人工体系中，使它们能够更好的为人们的各项生产贡献力量，需要通过特定的手段对其进行改造。在过去的几十年里，定向进化的出现为人工定制酶提供了可能性。2018 年诺贝尔化学奖就授予Frances H. Arnold，因其在酶的定向进化领域的贡献。这种方法的快速发展能够使酶产生优异的活性和立体选择性，这通常是对传统小分子催化剂的补充。尽管如此，目前人工定制的酶依然只能催化自然界中已经发现的各类反应，这无疑限制了定向进化酶的适用范围。

诺奖得主撤稿风波

2019年5月10日，加州理工学院Frances H. Arnold团队进一步采用定向进化技术，发展了一系列能催化非天然C−H酰胺化的细胞色素P450酶，精确控制同一个底物中不同位置C−H键的选择性，从而合成手性β-、γ-、δ-内酰胺。与传统的贵金属介导的C-H酰胺化相比，这种转化效率极高（总周转数高达1,020,000 ），选择性高（区域选择性高达25：1，选择性高达97％），并且制备过程简便。相关论文以“Site-selective enzymatic C‒H amidation for synthesis of diverse lactams”为题，发表在Science上。然而，该论文在2020年1月2日因为“实验结果无法重复”而被主动撤稿。（相关报道：）

中国学者再次发起挑战

为了实现使用具有优异催化性能的生物催化剂催化合成非生命系统的多功能性化合物，具有新功能的天然酶的发现和开发被广泛认为是现代生物催化和有机合成相关领域具有挑战性的目标。

左为博士后Zhou Qi,右为通讯作者Yang Yang助理教授。值得一提的是他们都师从北京大学王剑波教授

迄今为止，只有小分子催化剂存在的前提下，才能实现原子转移自由基环化反应 (ATRC)。近日，美国加州大学圣巴巴拉分校的Yang Yang教授团队改造了细胞色素P450，并将其应用于催化立体选择性原子转移自由基环化反应。该工作以题为“Stereodivergent atom-transfer radical cyclization by engineered cytochromes P450”发表在《Science》上，第一作者为Zhou Qi。

【反应原理简介】

作者认为，通过改造细胞色素P450中催化核心铁卟啉周围的肽链立体环境，配合铁卟啉的催化能力，可以实现立体选择性的反应。如图1所示，他们选择了羰基α位含有溴取代基的不饱和酰胺作为初始底物。作者认为，酶中所含有的铁卟啉可以夺取底物中的溴原子，使其转变为自由基，引发所谓的酶促自由基反应。随后，底物中的自由基碳原子与同一分子中位于远端的不饱和双键发生自由基加成反应关环，产生一个环状自由基中间体，随后位于铁原子上的溴原子被重新转移到该环状自由基上。选择该反应过程是由于氯化亚铁可以在一定条件下催化该过程的进行。由于所选择的底物中可以具有三个手性碳中心，配合酶反应口袋中的手性环境，可以立体选择性的得到手性产物。

图1. 酶催化反应原理

【催化反应可行性探索及酶筛选】

在该工作中，作者选择了通过定向进化策略改造血红素（P450s，珠蛋白和细胞色素 c）以及非血红素含铁卟啉的蛋白质，试图实现其设计的酶促反应。同时作者选择了小分子底物1a作为模型化合物，检验经过实验室进化改造过的含有铁卟啉的蛋白质酶催化的不对称关环反应的可行性。

作者在筛选了实验室中进化蛋白质库中的所有金属蛋白后发现，只有巨大芽孢杆菌 P450 (CYP102A1) 的丝氨酸连接变体提供了可被测量的对应体过量 [60:40，er] 和最高的活性。同时作者也发现，使用含有该种纯化蛋白的大肠杆菌的催化效率相比单纯的蛋白质催化剂的催化效率高出一个数量级。这是一个巨大的优势，这表示该催化剂在使用前无需进一步进行纯化，将大大加快蛋白质催化剂的工程化进程。

为了进一步提高这种自由基环化过程的对映选择性，作者通过位点饱和诱变（SSM）以及筛选的迭代循环进行定向进化，每一轮中都筛选了90个克隆。经过五轮蛋白质工程，通过定位靶向血红素辅因子附近的活性位点残基（包括残基 327、263、181、82 和 266）可以迅速提高产物2a的浓度。使用我们的最终金属酶变体P450ATRCase1（代号分别为P 与 T327I、I263Q、L181F、A82T 和 H266T），可以以优异的产率和对映选择性 [89% 的产率，总周转数 (TTN) 为 8110 和 97:3的对映选择性]得到所需的产物。作者通过进一步降低催化剂负载，在不影响对映选择性的情况下实现了 20,000 的 TTN。另外，作者还发现他们之前的工作中为对映选择性C-H功能化所设计的一种丝氨酸连接的P450变体（P411Diane2）也对这种反应有活性，并且具有倒转的对映选择性。

图2. 反应效果

图3. 酶的筛选

【底物范围筛选】

作者对其改造过的金属酶催化剂所使用的底物范围进行了探索。实验中使用了广泛的底物。发现酰胺氮原子上的一系列取代基均可耐受。同时对于一些高张力的四元环酰胺的对应选择性合成也具有非常好的合成效率。

图4. 底物适用范围筛选

【进一步发展应用】

值得注意的是，上面提到的手性中心的控制仅仅是对于成环过程中的手性控制。作者在其良好效果的鼓舞下开始思考能不能通过类似的催化剂筛选进化方式实现在溴原子与碳自由基中间体重新成键过程中的手性。为此，作者筛选进化得到了两种P450变体，代号为P‘与P450ATRCase gen-4，可以取得较好的非对应选择效果。通过 SSM 和筛选的迭代轮次，作者又设计了一组正交的高选择性生物催化剂，包括 P450ATRCase3 和 P450ATRCase4，可以实现产物2o 或 2o-dia 的非对映选择性合成。

此外，作者还对所合成的手性关环产物进行了后续的功能化，可以实现对溴的各种取代，例如取代为叠氮基或者氰基等等。

图5. C-Br键形成过程的手性控制及后续合成

总结，该工作使用定向进化策略筛选得到了几种细胞色素P450金属酶催化剂的变体，可以实现高度对应选择性的自由基关环反应以及C-Br键形成过程中的手性控制。利用这种技术实现了天然酶无法实现的化学反应。大大加快了酶促反应的应用进程。为后续生物有机合成的发展提供了更多机会。

来源：高分子科学前沿

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