ChemBridge化合物库筛选揭示调节ASK1抑制性磷酸化的内源性新机制

本研究中使用的无专利限制、多样性强、成药性好、命中率高、活性高、更易优化的类药性化合物库ChemBridge DIVERSet是一种市售的化合物库，由10余万个具有广泛药效团多样性的化合物组成，是目前欧美科学界公认的“最好的多样性化合物库”！国内众多顶级科研机构均已购买。ChemBridge于1993年成立于美国芝加哥。26年前，在世界范围内第一个推出基于3D药效团设计的多样性化合物库。早在1996年便可提供全产品的质控图谱并完成所有产品的二维码编号。经过近30年积累，目前已拥有超130万个类药性化合物，超13000个大环类化合物，超14000个化学砌块，累计为全球客户提供了超过3000万个化合物。与Pfizer、Merck、AstraZeneca等国际知名制药企业均有深度合作。AbMole奥默生物是ChemBridge中国区唯一官方指定合作伙伴。

在本研究中，采用化学生物学方法研究内质网应激诱导的细胞死亡机制。使用基于细胞的高通量筛选 (HTS) 试验来鉴定从毒胡萝卜素诱导的细胞死亡中拯救神经元细胞系的化合物，研究中鉴定了苯二氮卓酮，可选择性抑制由内质网应激诱导剂（毒胡萝卜素和衣霉素）引起的细胞死亡，但不抑制外源性诱导剂引起的细胞死亡。这些苯二氮卓类化合物抑制与Ire1α 通路相关的生化事件，包括调节凋亡信号激酶 1 (ASK1) 的磷酸化和抑制 JNK 和 p38 MAPK 的下游激活。

研究中，选了平均浓度为 15 µg/ml (~20–50 µM) 的 50,000 种小分子化合物的 Chembridge DIVERset 化学库，使用 HTS 分析从中鉴定了 198 种主要苗头化合物。其中，93 种化合物在重新测试时得到确认。其中，活性化合物CID-2879344和CID-2891837均来自于Chembridge DIVERset 化学库。结构式分别如下图所示：

Fig 1. A. CID-2879344结构式（#5976228） B. CID-2891837结构式（#6239507）

化学信息学数据分析显示，26 个确认的活性化合物中的 11 个构成了一系列 11 个结构相关的苯二氮卓酮（EC50 值范围从 10 到 25 µM），化合物 CID-2891837 是 11 种苯二氮卓酮中最有效的 (EC50 7.1 µM)，如图2所示。

Fig 2. Identification of cytoprotectivebenzodiazepinone by HTS.

研究中检测了化合物对TG处理的原代小鼠皮层神经元的活性。暴露于 5 µM TG 18 小时后，原代皮质神经元细胞显示回缩的神经突和浓缩的细胞核，这是典型的细胞凋亡。用 TG 和 DMSO（对照）处理的原代神经元中有一半以上在 18 小时内发生凋亡，而在用 TG 和化合物 CID-2891837 处理的培养物中，神经元凋亡并未显著高于未处理的细胞（图3D）。因此，可以得出结论，活性苯二氮卓类药物如 CID-2891837 具有神经保护活性。

Fig 3. Benzodiazepinones selectivelyprotect against cell death induced by ER stress.

通过磷酸化特异性抗体免疫印迹，被观察用活性苯二氮卓酮衍生物（CID-2891837、CID-2891533、CID-2891714、CID-2882794 和 CID-2879344）培养的细胞增加了丝氨酸 967 磷酸化，而 845 和丝氨酸 83 未调制，如图4 A、B所示。当细胞与无活性的苯二氮卓酮 CID-2882293 一起培养时，获得了类似的结果。相比之下，当细胞与活性苯二氮卓酮 CID-2891837 一起培养时，丝氨酸 967 磷酸化在添加 TG 之前升高并保持升高。因此，活性苯二氮卓类药物会破坏 ASK1 丝氨酸 967 磷酸化的正常模式。

制备裂解物并进行 GST pulldown 以回收 GST-14-3-3 蛋白，并用抗 HA 抗体对蛋白质复合物进行免疫印迹以检测相关的 HA-ASK1 蛋白。在 DMSO 处理的对照细胞中，TG 最初在 0.5小时诱导增加，然后在 1小时减少 HA-ASK1 与 GST-14-3-3 的结合，这与丝氨酸 967 磷酸化的变化相关（图 4D）。 使用无活性的苯二氮卓酮 CID-2882293 处理的细胞进行了类似的观察。相比之下，当细胞用活性苯二氮卓酮 CID-2891837培养时，HA-ASK1 与 GST-14-3-3 的结合增加，而与毒胡萝卜素处理无关（图 4D）。

为了将这些研究扩展到内源性 ASK1 和 14-3-3 蛋白，研究中使用肿瘤细胞系 OVCAR5 和 SNB19 进行了实验，与 293T 细胞相比，它们含有更高水平的这些蛋白质。内源性 ASK1 被免疫沉淀，并通过免疫印迹检测结合 14-3-3。在这些细胞中，TG对ASK1 与 14-3-3 的相互作用几乎没有影响，但活性苯二氮卓酮CID-2891837 产生一致的结果，导致内源性 ASK1 与 14-3-3 的关联增加（图 4E）。

Fig 4. Benzodiazepinone compounds increaseSer-967 phosphorylation of ASK1 and association with 14-3-3.

尽管本研究展示了化合物作用机制的物理证据，但研究中描述的细胞保护性苯二氮卓化合物调节 ASK1 磷酸化和活性的详细机制仍有待阐明（图 5）。另外，关于磷酸酶，已报道钙调神经磷酸酶（PPase3，以前称为 PPase2B）使 ASK1 的丝氨酸 967去磷酸化。然而，本研究中没有使用体外 ASK1 去磷酸化试验观察到化合物 CID-2891837 对钙调神经磷酸酶的抑制作用，这意味着钙调神经磷酸酶不是细胞保护性苯二氮卓类化合物的直接靶标。

Fig 5. Illustration showing site of actionof cytoprotective benzodiazepinone compounds in comparison with salubrinal inmodulating UPR pathways.

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