EGCG对大豆蛋白结构的调控机理

大豆分离蛋白（SPI）是一种常用的食品添加剂，其优良的功能性可被应用到食品中满足人们的需求。在食品加工中大豆蛋白具有的天然功能性质不足以满足食品工业对其功能性的需求，因此，通过对大豆蛋白分子结构的改良，从而使理化性能得到改变，进而达到对蛋白质功能性质加强或改善的目的。

热处理环节在喷雾干燥、复性等生产加工过程中必不可少，而不可避免地会对大豆蛋白的结构及功能性质造成影响。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为茶多酚提取物儿茶素中的最主要活性成分，具有很强的抗氧化性及抗癌等功效，却鲜有出现EGCG单体对大豆蛋白结构调控机理的探究。东北农业大学食品学院的赵思明、江连洲、周麟依*、范志军*等人通过对不同浓度EGCG-SPI复合物进行热处理，以及温度对EGCG-大豆蛋白复合体结构的影响，拓宽大豆蛋白食品的应用范围，为生产功能型EGCG-大豆蛋白复合产品提供理论依据，同时对复合物的开展与实施具有一定的现实意义与应用价值。

1、EGCG与SPI结合机理

根据Stern-Volmer方程作图，以[Q]为自变量，F 0 /F为因变量，得到EGCG对SPI的内源光猝灭曲线图，由直线的斜率可以计算SPI-EGCG复合体系的动态猝灭常数及双分子猝灭速率常数（图1A），结果见表1。如果Stern-Volmer曲线斜率随着温度的升高而增，即猝灭常数增大，EGCG对SPI的猝灭方式为动态猝灭，反之则为静态猝灭。由图1A可以看出，SPI的Stern-Volmer曲线斜率随着温度的升高而减小，说明EGCG对SPI的猝灭方式为静态猝灭。正常条件下猝灭剂对于生物大分子的最大猝灭常数为2×10 10 L/（mol•s），由图1B可知，EGCG对SPI的荧光猝灭速率数量级均为10 12 ，高于2×10 10 L/（mol•s），此结果进一步说明EGCG对SPI猝灭方式为静态猝灭。

2、SPI-EGCG复合体系结合度分析

由图2可知，室温下SPI与EGCG的复合物（pH 7.4、2 h、EGCG质量浓度为0、0.05、0.1、0.15 mg/mL）的结合率分别为（63.74±0.50）%、（69.58±0.55）%、（75.86±0.60）%，说明SPI与EGCG的结合率随EGCG质量浓度的增大而升高。复合体系热处理后结合率增加，且随着EGCG质量浓度的增大而升高。这是由于热处理使SPI的空间结构展开，更多的疏水基团暴露出来，使SPI与更多EGCG通过疏水相互作用结合，提高结合率。

3、SPI-EGCG复合体系的红外光谱分析

傅里叶变换红外光谱与拉曼光谱是2 种探究蛋白二级结构技术，二者之间具有互补性（图3）。对复合体系中SPI的酰胺I带做二阶导数，通过计算得到复合体系SPI二级结构的定量信息。

由图4、表3可知，SPI-EGCG复合体系的酰胺I带的吸收峰强度低于纯SPI，同时复合物中SPI的酰胺I带从纯SPI的1 635.48 cm－1红移至1 645.82 cm－1左右。SPI-EGCG复合物中SPI的酰胺I带在1 600～1 700 cm－1处发生了峰位的改变，说明EGCG与SPI的复合会使SPI的二级结构产生不同程度的改变。室温下，随EGCG质量浓度的增大，β-折叠相对含量随之减小，α-螺旋相对含量随之增大。

4、SPI-EGCG复合体系的拉曼光谱分析

SPI主链结构特征拉曼光谱分析

由图6、表4可知，不同质量浓度的EGCG与SPI相互作用后，SPI的二级结构均发生了改变。室温下，随着EGCG质量浓度的增大，SPI结构中β-折叠与β-转角相对含量的随之减小，α-螺旋与无规卷曲的相对含量随之增大，但β-折叠与无规卷曲相对含量的变化较小。说明更多的β-折叠转化成了较稳定的α-螺旋结构。这与红外光谱所得结论一致。

SPI侧链结构特征拉曼光谱分析

如表5所示，随着EGCG质量浓度的增加，色氨酸谱带强度的降低，表明EGCG使色氨酸残基向“暴露式”方向转变，导致EGCG与更多疏水性残基发生疏水相互作用而结合。复合体系热处理后，拉曼图谱中色氨酸谱带强度的降低，说明蛋白质受热后更多的色氨酸暴露出来。已有研究表明：蛋白质的结构受热会发生改变，使色氨酸残基的暴露出来，所以色氨酸谱带强度在拉曼谱图中呈先降低的趋势。

SPI二硫键构型的拉曼光谱分析

结合表6可以看出，SPI二硫键的主要构型为g-g-g模式。随着EGCG的加入，大豆蛋白二硫键构型发生显著变化，由g-g-g模式转化为g-g-t和t-g-t模式。而热处理后大豆蛋白的二硫键构型主要向t-g-t振动模式转换。这主要因为t-g-t代表分子间的二硫键的振动模式，热处理加强了分子间的交互作用，而EGCG的加入导致分子内的振动模式g-g-g增加，分子内二硫键含量增多，分子间的二硫键减少，说明EGCG与SPI形成稳定的复合物。

5、SPI-EGCG复合体系荧光光谱分析

由图7可知，室温下EGCG与SPI的相互作用对SPI的荧光有猝灭作用，并且猝灭效果随着EGCG质量浓度的增大而增强。同时SPI的最大荧光发射波长发生了一定的红移，从纯蛋白的335 nm红移到355 nm，这说明EGCG与SPI发生相互作用，从而使SPI的结构发生了改变，使色氨酸与酪氨酸所处环境由疏水变成了亲水，进而使肽链的结构变得舒展。复合体系经热处理后，SPI的最大荧光强度较未处理下的SPI增加，同时最大发射波长发生了轻微的红移，表明热处理使更多的色氨酸暴露出来同时所处环境转移到了更亲水或极性微环境中，这是由于SPI在热处理下空间结构发生了改变。同时EGCG对SPI的猝灭作用大于热处理前，且SPI的最大荧光发射波长发生了一定的红移。这是由于热处理使SPI发生了变性结构展开，使更多的色氨酸残基被EGCG猝灭。

6、SPI-EGCG复合体系紫外-可见光谱分析

由图8可知，室温下随着EGCG质量浓度的增加，复合体系的紫外-可见光吸收光谱的最大吸收峰发生了不同程度的红移，说明EGCG与SPI的相互作用导致SPI的空间构象发生了改变。

结 论

以实验室自制的SPI与EGCG作为研究的原料，制备SPI-EGCG复合体系，二者的猝灭方式为静态猝灭，且作用力为疏水相互作用。通过红外光谱和拉曼光谱的分析，EGCG对SPI的调控使SPI二级结构产生不同程度的改变。热处理前后，SPI二级结构均出现随EGCG质量浓度的增大β-折叠相对含量随之减小，α-螺旋相对含量与随之增大的现象。并且拉曼光谱侧链显示EGCG与SPI的疏水侧链基团通过疏水相互作用结合，且热处理使二者之间的相互作用增强。荧光光谱和紫外-可见光光谱表明：热处理前后EGCG对SPI结构的调控均对SPI的荧光有猝灭作用，且热处理后的猝灭效果更强。

本文《EGCG对大豆蛋白结构的调控机理》来源于《食品科学》2021年42卷12期67-75页，作者：赵思明，江连洲，王冬梅，隋晓楠，周麟依，范志军。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200523-273。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网

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