《Nano Letters》斯坦福大学崔便晓: 似软水凝胶，纳米级表面形貌通过增强整合素内吞作用来降低粘着斑和细胞硬度

【介绍】

基材刚度和表面形貌都通过机械转导信号通路调节细胞行为。这种相互交织的影响表明，工程表面形貌可能会替代或抵消生物医学应用中基材刚度的影响。然而，细胞识别地形特征的机制尚不完全清楚。

【摘要】

最近， 斯坦福大学 崔便晓教授 团队 证明 纳米拓扑的存在极大地改变了细胞行为，使得在刚性玻璃基板上培养的神经元和干细胞表现得就像在软水凝胶上一样。通过原子力显微镜，团队表明刚性纳米形貌类似于软水凝胶在降低细胞刚度和膜张力方面的作用。

此外，团队发现纳米拓扑结构通过增强内吞作用和随后整合素受体的去除来减少粘着斑和细胞刚度。这种机械理解将支持纳米形貌的合理设计，引导刚性材料上的细胞表现得好像它们在柔软的材料上一样。相关论文以题为 Nanoscale Surface Topography Reduces Focal Adhesions and Cell Stiffness by Enhancing Integrin Endocytosis 发表在《 Nano Letters 》上。

【图文解析】

刚性纳米柱以类似于软水凝胶的方式加速神经突的生长

首先比较了纳米拓扑结构和基底刚度如何调节胚胎神经元的发育。 石英的杨氏模量约为 72 GPa，而相比之下使用的聚丙烯酰胺水凝胶的杨氏模量为 1.04 kPa（称为 1 kPa 水凝胶）。通过电子束光刻和反应离子蚀刻制造石英纳米柱的准确形貌特征（图 1a）。

图 1. 石英纳米形貌上的细胞行为与软水凝胶上的行为相似。

团队测量了响应三种类型表面的轴突生长：刚性扁平石英、刚性纳米柱石英和柔软的扁平水凝胶表面。 电镀后 20 小时，平坦石英表面上的胚胎 E18 海马神经元大多是圆形的短延伸，与先前使用平坦刚性基板的研究一致。相比之下，纳米柱表面上的很大一部分神经元在同一培养物中具有长轴突（图 1b）。在水凝胶上培养的海马神经元在 20 小时后也长出长神经突，这与之前使用软基质的报告一致。统计分析表明，在纳米柱 (24.7%) 和 1 kPa 水凝胶 (19.0%) 上，具有至少一个长于 35 μm 的神经突的神经元百分比显 着高于扁平石英 (0.8%)（图 1c）。这些结果表明纳米形貌加速神经突的生长。

刚性纳米柱以类似于软水凝胶的方式降低细胞刚度和膜张力

团队利用原子力显微镜 (AFM) 来比较纳米形貌和基底刚度如何影响细胞刚度和膜张力。接触模式 AFM 显示扁平石英上的细胞在细胞核周围有可见的细胞骨架纤维，但纳米柱上的细胞表现出非常小的形状，没有可辨别的应力纤维（图 2a）。通过将赫兹压痕模型拟合到从每个单元获得的力-分离曲线来提取单元刚度（图 2b、c）。发现石英纳米柱上的细胞明显比扁平石英上的细胞软，杨氏模量降低了 46%，并且刚度与 1 kPa 水凝胶上的细胞相当（图 2d）。 根据测量，石英纳米柱上细胞的平均系绳力比平面低 15%，与 1 kPa 水凝胶基材上的相似（图 2f）。这些 AFM 测量清楚地表明，纳米柱石英和软水凝胶上的细胞比平坦石英表面上的细胞软得多。

图 2. 石英纳米形貌以类似于软水凝胶的方式降低细胞刚度和膜张力。

当细胞面积和形状受到控制时，纳米拓扑会抑制 YAP 活性

团队发现石英基板上纳米柱的存在大大降低了细胞面积和 YAP 活性（通过 YAP 细胞核/细胞溶胶比率测量）（图 3a、b），这与之前的纳米拓扑学研究一致。生物打印方法使用紫外线诱导的切割来指定随后涂有细胞粘附分子（如明胶）的区域。未暴露的区域用聚乙二醇覆盖以防止细胞粘附。水凝胶与生物打印不兼容，不包括在此处。

图 3. 当细胞面积和形状受到限制时，纳米拓扑会抑制 YAP 活性。

纳米拓扑学通过增强整合素受体的内吞作用来减少局部粘连

通过免疫染色关键蛋白成分，包括丝状肌动蛋白 (F-actin)、整合素 β1、纽蛋白、桩蛋白和磷酸化粘着斑激酶（图 4a,b）。我们量化了大粘着斑的数量（在 U2OS 细胞中 >1 μm2） 主要负责力的产生和基板刚度传感。当在平坦的石英表面上培养时，U2OS 细胞每个细胞有大约 20 个大的粘着斑，但它们几乎失去了纳米柱上的所有大粘着斑（图 4c）。这种粘着斑的显着减少和 纳米柱上的应力纤维可能解释了这些表面上细胞刚度的降低。

图 4. 纳米拓扑通过增强整合素的内吞作用来减少粘着斑。

纳米拓扑结构微调细胞机械转导

为了进一步支持纳米拓扑结构通过膜曲率介导的内吞作用调节机械转导的假设（图 5a）， 团队 系统地研究了纳米拓扑结构如何影响细胞面积和 YAP 活性。在这项研究中，我们将纳米柱间距从 1 到 5 μm，高度从 1 到 3 μm，直径从 200 到 1000 nm（图 5b）。作为对不同基材刚度的参考， 团队 制作了一系列 1 到 14 kPa 的聚丙烯酰胺水凝胶。 团队首先通过改变间距和高度同时保持纳米柱直径不变来改变弯曲膜面积。 如图 5c 所示，平坦石英表面上 hMSC 的细胞面积明显大于水凝胶和石英纳米柱上的细胞面积。对于水凝胶组，当水凝胶刚度降低时，细胞面积减少，说明了刚度效应。对于相同高度（1 或 3 微米）的纳米柱，平均细胞面积随着每个基板面积的弯曲膜面积通过将间距从 5 微米减少到1μm而减少（图 5c）。对于相同间距的纳米柱，随着纳米柱高度从1μm 增加到 3 μm 以增加弯曲膜面积，平均细胞面积减小。此外，随着弯曲膜面积的增加，YAP 细胞核/细胞质比通过减小间距或增加高度而降低（图 5d）。

图 5. 细胞机械转导的组成部分可以通过改变纳米拓扑几何形状在很宽的范围内进行微调。

【总结】

团队证明纳米拓扑结构可以显着调节细胞机械转导，使细胞以类似于它们对软水凝胶 (1-14 kPa) 的反应的方式对刚性纳米柱底物 (72 GPa) 作出反应。 团队 发现纳米拓扑诱导的膜曲率增强了整合素受体的内吞作用，这导致细胞表面上的整合素受体减少，随后粘着斑和应力纤维的分解。广泛的研究表明，软基材不能对应力纤维产生的牵引力提供足够的抵抗力，而 该团队 和其他人已经表明，纳米拓扑结构会导致膜弯曲。有趣的是，尽管基底刚度和表面形貌最初以不同的方式起作用，但这两种物理线索会聚在调节整合素受体上。这些发现将支持表面形貌的合 理设计，例如使刚性植入物上的细胞表现得好像植入物具有与天然组织相似的刚度。

参考文献：

doi.org/10.1021/acs.nanolett.1c01934

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