基于酶学特性筛选大曲来源芽孢杆菌用于强化酿酒

中国酿酒行业已有数千年的历史，白酒属于我国特有酒品，其年消耗量位于世界蒸馏酒第一，其中浓香型、酱香型和清香型白酒是三大主要香型白酒，多年来持续主导市场地位。白酒多以大曲作为糖化发酵剂进行开放式固态发酵，大曲为白酒酿造提供了必须的微生物及酶资源，造就了白酒独特的风味和品质。提高白酒发酵过程稳定性和提升白酒质量是目前整个白酒行业发展的共同目标和技术难题。

食品质量与安全北京实验室，中国农业大学食品科学与营养工程学院的黄晓宁、陈晶瑜*等人选用前期分别由浓香型、酱香型和清香型大曲中分离得到的105 株芽孢杆菌进行淀粉酶和蛋白酶活力测定，筛选特性优良菌株用于白酒强化发酵，验证其对挥发性代谢物质的贡献。通过筛选得到内源性特定功能芽孢杆菌，为白酒强化发酵及大曲发酵剂体外重建提供理论基础和菌株资源。

1、芽孢杆菌酶活性评价

淀粉酶和蛋白酶活性测定

如图1所示，清香型大曲来源的芽孢杆菌酶活力普遍较高，其中枯草芽孢杆菌B.S-1与地衣芽孢杆菌B.L-1具有最高产淀粉酶和蛋白酶能力，其淀粉酶活力分别为（92.6±1.6）、（71.1±2.4 ）U/mL，蛋白酶活力分别为（66.4±3.6）、（56.6±2.4） U/mL。而浓香型和酱香型来源的芽孢杆菌酶活力普遍低于清香型大曲，此结果与Liu Jingjing等研究结果一致，清香型大曲的淀粉酶活力普遍高于浓香型和酱香型大曲。

芽孢杆菌发酵液SDS-PAGE及蛋白酶谱分析

以淀粉酶活力为13 U/mL作为临界值，选择酶活力相对较高的14 株芽孢杆菌粗酶液中的蛋白质分布情况（图2），通过SDS-PAGE分析，可见芽孢菌内蛋白质分子质量分布较广，同时存在同种菌株内蛋白差异性。其中B.S-1发酵液中蛋白酶种类最丰富（图3a）。由于B.L-1和B.S-1的淀粉酶和蛋白酶活力最高，蛋白酶谱中显示的蛋白酶种类丰富，因此选用这2 株菌进行强化发酵。

2、芽孢杆菌强化发酵

理化指标分析

酒醅理化指标的测定，是衡量白酒发酵的重要参数。发酵结束后，分别测定酒醅中的水分含量、酸度及pH值（图4A）。模拟发酵中理化指标pH值、总酸度和水分含量总体与工厂大生产结果相似。强化B.S-1组水分含量高于对照组，强化B.L-1组总酸度高于对照组，可能由于强化B.L-1后，增加了有机酸含量，或是减弱了酒醅微生物对酸性物质的降解作用，但3 组之间pH值并无显著性差异。故强化发酵后，酒醅基本理化指标并未出现很大差异，发酵稳定进行。

挥发性代谢物分析

发酵酒醅中共检测得到38 种挥发性物质，包括酯类、酸类、醇类、醛酮类、酚类和杂环类。其中强化B.L-1组中的中的酯类、酸类、醇类和其他类物质的总含量明显高于对照组，而强化B.S-1组中酯类，酸类和醇类与对照组无显著性差异，醛酮酚类物质含量显著提高（图4B）。通过对比不同类别代谢物分组中的各物质的相对丰度（图5），可以看出，B.L-1和B.S-1强化发酵后乙酸乙酯的相对含量均有所提高。

3、挥发性风味物质差异代谢组分析

总体代谢物层级聚类和PCA

基于强化发酵后风味物质的构成，采用HCA对不同实验组进行聚类（图6A），B.L-1组较B.S-1组和对照组距离更远，说明代谢物变化较大。通过PCA模型从整体上反映添加不同芽孢杆菌强化后的发酵酒醅中的代谢差异，累计 模型拟合度良好。 B.L-1 组与对照组在 PC1 方向上差异显著，而 B.S-1 组和对照组在 PC2 方向上差异较显著（图 6B ），通过图 6C 看出，乙酸乙酯、辛酸乙酯、 2- 甲基丁酸酯、己酸乙酯苯乙醛等物质贡献了 PC1 方向的得分，而乳酸乙酯、苯乙烯、 4- 乙基 -2- 甲氧基苯酚、辛酸、 4- 乙基苯酚、 1- 己醇等物质贡献了 PC2 方向的得分（图 6C ）。

差异代谢产物分析

采用同时满足基于PLS-DA模型的变量投影重要度VIP＞1、变量差异倍数（fold change，FC）＞1.5或FC＜0.5和t检验P≤0.05确定强化组分别与对照组的差异代谢产物，结果如表2所示，在强化B.L-1和B.S-1组分别有21 个和11 个差异代谢物。其中4-乙基-2-甲氧基苯酚，辛酸乙酯，3-甲基丁酸乙酯，四甲基吡嗪在2 组强化中均显著性增高。4-乙基-2-甲氧基苯酚又称4-乙基愈创木酚是白酒中的特征香气物质之一，其来源主要是通过微生物降解与木质素相关的酚酸类物质形成。

结 论

通过对浓香，酱香和清香型大曲中分离得到的芽孢杆菌淀粉酶和蛋白酶特性的分析，筛选出地衣芽孢杆菌B.L-1和枯草芽孢杆菌B.S-1，模拟清香型白酒发酵工艺进行强化发酵。发酵结束后强化B.L-1组酒醅中多种挥发性物质含量显著高于对照组，而强化B.S-1组中主要是醛酮酚类物质含量有所提高。其中4-乙基-2-甲氧基苯酚、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、四甲基吡嗪在2 组强化中均为差异代谢物，含量显著升高。通过强化不同芽孢杆菌进行模拟发酵可以显著提高酒醅中挥发性物质含量，菌株B.L-1和B.S-1均具有作为功能微生物进行大规模强化发酵的潜力，也可用于大曲人工合成群落中淀粉及蛋白质降解功能菌及健康因子产生菌进行进一步的研究。同时，基于酶学特性分析进行产酶优良菌株的筛选是一种高效的功能菌株筛选途径，可广泛用于白酒及其他传统谷物类发酵食品中。

本文《基于酶学特性筛选大曲来源芽孢杆菌用于强化酿酒》来源于《食品科学》2021年42卷10期218-224页，作者：黄晓宁，刘晶晶，韩北忠，陈晶瑜。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200407-073。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网

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