线粒体单链结合蛋白调控线粒体基因组复制

责编 | 酶美

线粒体，作为细胞内的“发电站”，通过氧化磷酸化将食物转化为机体维持正常功能所需要的ATP。这一重要功能严格依赖其独特的基因组（mitochondrial DNA, mtDNA）的正常表达。人的mtDNA约16.5kb，为双链螺旋闭环DNA，根据双链中GC含量的不同被人为定义G含量高的一条为重链，另一条为轻链。哺乳动物mtDNA共编码37个基因，其中包括2个线粒体核糖体RNA（rRNA），22个线粒体转运RNA（tRNA）和13个信使RNA（mRNA，均用于表达位于线粒体内膜的氧化磷酸化核心组分）。人的不同细胞内含有不同数量的mtDNA，通常单个体细胞内mtDNA拷贝数为1000-10000，而卵细胞内含有多至数十万拷贝的mtDNA，因此维持特定细胞内足够量的mtDNA对细胞行使正常功能至关重要。

细胞内mtDNA水平的维持依赖于其不断复制增加，复制受损会使机体内线粒体mtDNA缺失或者产生突变，从而导致机体功能障碍。如同真核细胞核基因组复制需要复制蛋白复合物（replisome）一样，mtDNA的复制也存在一套独特的复制复合物，其中包括了线粒体DNA聚合酶（PolgA）、解旋酶（Twinkle）及线粒体单链结合蛋白（mtSSB）等。而区别于真核基因组复制，mtDNA的复制存在其独特性质：1）mtDNA的复制起始需要的RNA引物不是由引物酶合成，而是由线粒体RNA聚合酶（POLRMT）生成，该酶是线粒体内负责mtDNA转录的最主要的合成酶。因此，mtDNA的复制与其转录紧密相关，而这种转录耦合的复制过程调控机制，到目前为止仍然未知。尽管有体外数据提示线粒体转录延伸因子（TEFM）可能在此过程中协调单个mtDNA在转录和复制状态间切换，但TEFM体内敲出的小鼠模型证实了TEFM并非参与这一过程。2）区别于真核基因组先导链及滞后链的同步复制模式，哺乳动物mtDNA复制模式主要采用链替换模式（strand displacement model，SDM）：即重链和轻链并非同时开始复制，而是从轻链转录起始开始合成一段RNA作为复制引物，随后经过加工处理，由重链复制起始点开始，先合成新的重链，复制至全长约三分之二处，到达轻链复制起始点后， POLRMT再次在此处合成RNA引物，促使轻链得以开始合成，新合成的双链最终分别替换了原来的重轻链。在此期间，作为轻链合成模板的原重链处于单链状态，并由mtSSB环绕结合以维持稳定状态。这些mtDNA独有的特性，使得研究者们对细胞内调控mtDNA的更多分子产生兴趣。

为了挖掘更多的参与mtDNA复制调控蛋白，作者们利用RNA干扰的方式，利用荧光原位杂合（FISH）呈现mtDNA的方式，在细胞层面对线粒体定位的1142个蛋白对应的基因进行一一敲低和筛选，检测到一系列对mtDNA起到调控作用的基因。其中，敲低mtSSB显著降低了mtDNA水平，提示mtSSB可能是一个影响mtDNA水平的关键因子。这项成果于近日发表于Science Advances上，题为：The mitochondrial single-stranded DNA binding protein is essential forinitiation of mtDNA replication。

为了进一步探索体内mtSSB对mtDNA的调节功能，考虑到小鼠mtDNA与人的mtDNA高度同源，作者们利用小鼠作为模式动物，构建了全身敲除mtSSB基因的小鼠，发现其因mtDNA缺失，发育阻滞在胚胎时期。于是作者利用Cre-Loxp系统，对mtSSB进行心脏和肌肉组织的条件性敲除，并对此模型进行一系列的生化分析。与预期推测一致，敲除小鼠的因心脏出现了mtDNA大量缺失，发展出心肌病，死于18周周龄。作者们随即对早期不同周龄小鼠进行分析。比较有趣的是从4-5周开始，尽管心脏形态学层面还未发生病理学改变，但整体mtDNA水平已经下降至对照组的15%左右。为了避免小鼠心脏出现病理变化后大量继发性改变干扰进一步挖掘mtSSB对mtDNA调控的上游机制，作者在后续研究工作均利用4-5周龄左右的健康小鼠进行研究。通过纯化心脏线粒体在体外进行mtDNA新合成测试（in organello replication），及经典的用于评估DNA复制起始点的二维凝胶电泳等实验，充分证实了缺失mtSSB后mtDNA复制无法起始，而并非是复制中途的停滞。

前文已经提及到mtDNA复制的独特性：转录耦合的复制起始。为了探究mtSSB对这一特殊复制模式的复制起始的调控机理，作者们分析了mtSSB敲除心脏的转录组，比较惊奇的是：在5周龄小鼠的线粒体转录本中，重链转录出的mRNA及tRNA与mtDNA水平一致，均低于对照组，相反，轻链转录出的唯一的ND6 mRNA及多个tRNA明显高于对照组。这一发现进而在人类HeLa细胞上进一步被证实，且通过BrU标记的方式证实了轻链转录的能力确实大大增加。并且，在本文筛选到的影响mtDNA复制的70多个基因中，只有mtSSB及PDK4较低才会出现轻链的新转录能力增高（此次工作并未对PDK4进行深入，推测其对转录本的影响可能是其对糖脂代谢的调控导致的继发结果）。与上调的轻链长转录本（ND6及多个tRNA）截然相反的是，由轻链转录起始点转录出的提前终止的转录本7S RNA完全消失（这些转录本天然存在，多数为轻链起始转录后，在保守区域「conserved sequence box 3，2，1」提前转录终止而产生，推测与mtDNA的复制引物相关），尽管这些提前终止的转录本功能未知，但其充分证明了在缺失了mtSSB的情况下，轻链起始的转录更倾向于mtDNA全长转录，而非提前终止的转录，而后者与mtDNA的复制紧密相关。因此这些数据提示了mtSSB调控mtDNA分子转录和复制的切换。

此外，通过小RNA和RNA转录起点的测序，作者们证实mtSSB除了调控复制起始点外，还可以限制非特异性RNA的转录生成，继而推测其具有限定mtDNA复制起始点特异性的功能。为了检验上述的发现能否解释前期已报道的携带mtSSB的突变的临床线粒体疾病患者的mtDNA缺失，作者们体外表达纯化了一系列临床发现的mtSSB点突变蛋白，发现其中一些点突变丧失了单链DNA结合功能，并在进一步的体外复制起始实验中，不能够启动复制，揭示了这些突变导致患者mtDNA缺失的根本机制。

综合以上的发现，作者们证实了mtSSB在mtDNA复制起始过程中不可或缺，既可以于重链复制起始时调节转录与复制的切换，还可以在轻链复制起始时限制起始点之外的异常复制。这篇工作深入且充分研究了mtSSB在双链复制起始过程中的不同作用。并且，对mtDNA转录耦合的复制模式，提出了mtSSB为其调控关键因子，截至目前为止，这是有体内证据支持的第一个调控因子。

本文第一作者为西湖大学的蒋敏研究员，瑞典哥德堡大学的谢谢研究员及朱雪峰研究员。通讯作者为瑞典哥德堡大学的Maria Falkenberg教授及卡罗林斯卡医学院的Nils-Göran Larsson教授。

原文链接：

https://advances.sciencemag.org/content/advances/7/27/eabf8631.full.pdf