羊肚菌母种培养基最好采用黄豆芽、玉米粉、麦麸、蔗糖、苹果汁等多种营养成分配成的综合培养基，不能单单使用PDA培养基，避免营养成分单一化。从许多单位试验明显表示，常见的PDA培养基的母种菌丝增长长速度，比起综合培养基慢2倍:而且菌丝长势细弱，菌丝干重量也相差1.2倍。
准备的材料：豆芽200克(煮汁)，葡萄糖20克，琼脂20克，硫酸镁0.3克，磷酸二氢钾1.5克，维生素B8克，水1000毫升
三、培养基制备
1.将黄豆芽200克洗净放水中烧煮，将营养成分都煮出来。
2.在玻璃或金属容器内加1200mL水，煮沸20min，用4层纱布进行过滤并洗涤，挤压固体物后得到滤液1000mL。
3.将葡萄糖或蔗糖、琼脂、硫酸镁、磷酸二氢钾，维生素B等加入溶解，都溶化后，然后分装到试管中。
4.分装的高度可以是试管总长度的1/7~1/6、1/5~14、1/3，试管口先用棉塞塞上。粘到管口的培养基须擦干净，然后盖紧硅胶塞。
5.灭菌锅为手提式高压灭菌锅的，装锅时要10支扎成一把，竖立排放整齐。盖锅盖时，要对角拧紧螺丝。当压力达到0.05MPa时，打开排气阀缓慢排净冷气;当压力达到0.12MPa时，123~125℃保持30min。灭菌期间须人不离锅，发现异常立即停火检查并消除隐患。
6.冷却:灭菌结束后自然冷却，压力归零即可打开锅盖。开始摆放试管斜面时，须保证液面顶端距硅胶塞内端大于2cm，防止液体粘到硅胶塞上。在摆好的试管上覆盖毛巾，防止出现冷凝水。
注意：
不要使用刚刚灭菌后摆成的斜面试管培养基，因为培养基表面有大量的冷凝水水珠，接种物如孢子、组织块、菌丝块很容易被淹没，菌丝容易死亡。特别是一旦接种物有细菌污染会导致全试管的污染，造成操作失败。
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