果蔬酶促褐变机理的研究进展

水果和蔬菜在贮运、包装或加工过程中受损后极易发生变色，这种现象被称为酶促褐变，一般发生在新鲜的活组织中，或者至少发生在含有活性酶的组织中。机械损伤后的褐变反应通常发生迅速且剧烈。酶促褐变极大地影响了果蔬外观和风味，使营养物质损失，降低了消费者的接受度，对食品生产商和食品加工业都产生重大的经济影响。据估计，热带和亚热带水果和蔬菜的损失超过50%是由酶促褐变造成的。

酶促褐变反应的基本步骤是酚类化合物在酚酶催化下氧化成邻醌类化合物，随后醌类物质经过一系列氧化缩合聚合形成褐色产物，从而导致褐变发生。发生酶促褐变的3 个必要因素分别为酚类底物、氧气、酶。国内外对食品褐变研究较多，但对于酶促褐变机理的研究比较零散，且不够深入。华中农业大学食品科学技术学院的李彩云、李 洁*、严守雷等人整理归纳了国内外围绕褐变机理进行的多酚氧化酶（PPO）和酚类底物的相关研究和报道，为酶促褐变机理的系统深入研究提供借鉴与参考。

1、PPO相关研究进展

PPO分类

PPO是酶促褐变反应的重要影响因素和必备条件，PPO是含有Cu 2+ 的酶。国际生物化学和分子生物学联合命名委员会提出，PPO包括3 种类型：第一种是单酚单氧化酶，亦称酪氨酸酶、单酚氧化酶、甲酚酶，这种酶能催化单羟基酚羟基化为邻二羟基酚；第二种是双酚氧化酶，亦称儿茶酚氧化酶、o-双酚酶，这种PPO能催化氧化邻位酚，但不能氧化间位酚和对位酚；第三种是漆酶，该酶能氧化邻位酚和对位酚，不能氧化一元酚和间位酚。现在所说的PPO一般是双酚氧化酶和漆酶的统称。

PPO催化位点

研究PPO的活性中心发现，铜离子存在于酶的活性中心，大多数PPO活性中心具有两个富含组氨酸（His）残基的Cu结合区域。通过核磁共振等方法得到的数据显示PPO活性中心每个铜离子与3 个His残基中的N原子形成配位键，形成了具有特定三维结构的活性部位，配位键中两个为赤道面配位键，一个为较弱的轴向配位键。这两个铜离子以赤道面与不同数目的氧原子产生配位结合而形成电子通路。

PPO提取、分离、纯化、纯度鉴定、活性测定的方法

PPO提取方法很多，通常根据PPO存在的植物种类来选择分离提取方法。从果蔬组织中提取分离PPO面临的一个主要问题是酚类底物和酶同时存在。在活组织中，这两种成分在细胞内单独分开存在，但在浸渍、提取和其他加工处理中，它们一旦由于组织细胞破损而接触就会产生醌和其他缩合产物，在提取时要注意去除酚类底物。

PPO粗提物大都含有许多杂质，还需要对其进行分离纯化。盐析和色谱层析法等是早期纯化PPO所常使用的 方法。使用硫酸铵进行分级沉淀后，通过透析去除无机杂质，然后通过色谱法进一步分离。

分离纯化出的PPO一般要进行纯度鉴定，为确保纯化完全，一般鉴定方法有层析法、电泳法、高效液相色谱（HPLC）、质谱法等。在整个分离纯化过程中要实时监测PPO活性，测定PPO活性的方法主要有分光光度法和氧电极法。

2、酚类底物相关研究进展

多酚种类

酚类化合物属于植物次生代谢产物，以苯环为基本骨架，以苯环的多羟基取代为特征，具有一系列的结构和功能。酚类化合物根据结构分为酚酸类、黄酮类、 1,2-二苯乙烯和木质素类。根据其碳骨架的不同可进一步细分（表2）。

影响植物组织多酚种类和含量变化的因素

不同品种的植物组织酚类化合物种类与含量差异较大。Khettal等从产于阿尔及利亚的7 个不同品种柑橘叶片中提取多酚化合物，得到各品种水提物中总酚和总黄酮含量分别为68.23～125.28 mg/g和11.99～46.25 mg/g （以干质量计，下同）。Tanriöven等测定了7 个不同品种梨汁中酚类物质的含量，得到绿原酸质量浓度为73.1～249 mg/L，表儿茶素质量浓度为11.9～81.3 mg/L，咖啡酸质量浓度为2.4～11.4 mg/L，对香豆酸质量浓度为0.0～3.0 mg/L。

种植方式会影响酚类种类及含量。Veberic等采用HPLC法测定了奥地利和斯洛文尼亚11 个有机栽培苹果品种和11 个综合生产苹果品种果皮和果肉中酚类化合物的含量，发现有机栽培苹果品种与综合生产苹果品种的 果皮酚类物质含量无显著差异；然而，有机种植的苹果果肉中酚类物质的含量高于综合生产的苹果品种。

提取方式也会影响测出的酚类种类和含量。Delgado-Torre等对18 个不同葡萄品种的水醇提物进行了比较研究，分别采用过热液体提取法、微波辅助提取法和超声波辅助提取法进行提取，与其他两种方法相比，过热液体提取法具有更高的提取效率。

不同成熟期也会影响酚类含量。Lachowicz等在大蒜的叶、根、茎和蒜根提取物中鉴定出了32 种山柰酚衍生物和4 种咖啡酸衍生物。3月份大蒜总酚含量为10.9～1477 mg/100 g，6月份大蒜总酚含量为6.5～1195 mg/100 g。甜菜叶在不同的成熟期褐变程度也不相同，甜菜叶从成熟3 个月到成熟8 个月，总酚含量从4.6 mg/g（以鲜质量计）增加到9.4 mg/g（以鲜质量计）。成熟8 个月的甜菜叶提取物的PPO活力是成熟3 个月叶提取物的6.7 倍。

3、酚类化合物的酶促氧化

酶促褐变发生的确切途径一直是人们关注的焦点。现在普遍认为涉及两个反应步骤。第一个反应是单酚羟基化为二酚，邻二酚羟基化为醌。酶促氧化的主要产物醌具有不同的光谱特性，其颜色取决于酚的来源和pH值。

酚类化合物在发生氧化的同时还会发生自身聚合。酚类物质的氧化聚合对果酒（白葡萄酒、苹果酒等）的口感和稳定性均有影响。张影陆等以黄酮类物质的典型代表儿茶素和酚酸类物质的典型代表绿原酸为研究对象，在模拟体系中通过液相色谱-质谱对其酶促氧化聚合进行了研究。发现单酚在酶促反应过程中确实会发生聚合，且不同的单酚表现出不同的聚合过程及不同的聚合速度。

酚类化合物可以通过不同途径氧化，氧化产物相似。Makris等研究了蘑菇PPO、辣根过氧化物酶和铁氰化钾3 种处理对槲皮素的氧化作用，发现槲皮素溶液经PPO、辣根过氧化物酶、铁氰化钾处理后得到的色谱图非常相似，得到的产物相同。

4、褐变抑制剂控制酶促褐变的机理研究

为了抑制果蔬褐变和保持果蔬品质，国内外科研工作者进行了大量广泛而深入的研究。在传统褐变化学 抑制剂中，亚硫酸盐被广泛用作褐变的抑制剂，但它会影响人体健康。因此，亚硫酸盐的替代物如有机酸、巯基氨基酸、酚类物质、天然产物等正在被作为可能的替代物而被深入研究。

许多有机酸是天然的褐变抑制剂，如柠檬酸、水杨酸、苹果酸、曲酸、草酸等。其抑制机理为：降低体系的pH值、络合金属离子、钝化PPO活性。抗坏血酸既是有机酸，又是还原剂，其抑制褐变机理是将氧化的醌还原为酚类物质，阻止醌类物质进一步自发聚合形成色素物质，抑制PPO活性，降低氧气含量。

半胱氨酸、乙酰基半胱氨酸和还原型谷胱甘肽等巯基氨基酸有很强的抗褐变能力。其抑制褐变的机制归纳起来为：一是醌类物质能与巯基化合物形成无色的复合物，中断了醌类物质聚合形成色素物质；二是巯基化合物可通过与PPO活性位点的铜离子不可逆结合而抑制酶活性，或者替代PPO活性位点的组氨酸残基；三是巯基化合物并非阻止PPO氧化酚类，而是阻止酚类的聚合。

结 语

酶促褐变机理研究对于控制新鲜果蔬的保鲜和加工品质具有重大意义。根据褐变机理，可以从抑制PPO活性、改变酶环境方面入手，或者从阻断酚类底物的聚合、抑制醌氧化、调节醌还原角度出发，减缓和抑制 褐变的发生。但是目前酶促褐变机理研究还存在一些瓶颈，首先，尽管已有大量研究表明PPO参与酶促褐变，但酶晶体的获得还是较为困难，目前对PPO高级结构的研究是以核酸序列、蛋白质序列为基础，利用计算机软件来模拟PPO空间结构、活性位点、底物结合区，其真实的高级结构至今仍未探明。其次，对酚类化合物复杂的代谢过程分析仍有难度，酚类化合物的种类越多，反应产物就会越复杂。再者，大多数研究通过模型体系来探讨酶促褐变机理，在真实的食品体系中研究较少，数据的获得和研究方法的可行性尚需进一步探讨。

本文《果蔬酶促褐变机理的研究进展》来源于《食品科学》2021年42卷9期283-292页，作者：李彩云，李洁，严守雷，王清章。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200401-008。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网

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