组织培养室（组培室）设计图及其场景

组织培养的分类

1、按外植体分，植物组织培养可分以下几类：

胚胎培养的植物，包括胚培养、胚乳培养、胚珠和子房培养，以及离体受精的胚胎培养技术等。

2、器官和组织培养器官培养是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的培养，包括茎段、茎尖、块茎、球茎、叶片、花序、花瓣、子房、花药、花托、果实、种子等。组织培养有广义和狭义之分。

广义：包括各种类型外植体的培养。

狭义：包括形成层组织、分生组织、表皮组织、薄壁组织和各种器官组织，以及其培养产生的愈伤组织。

细胞培养细胞培养包括利用生物反应器进行的，旨在促进细胞生长和生物合成的大量培养系统和利用单细胞克隆技术促进细胞生长、分化直至形成完整植株的单细胞培养。

3、原生质体培养植物原生质体是被去掉细胞壁的由质膜包裹的、具有生活力的裸细胞。

组织培养的接种

接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1%～3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行搽洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。

无菌操作的步骤

1．在接种4小时前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外线灯进行杀菌；

2．在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；

3．接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；

4．上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；

5．先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；

6．接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；

7．接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。

接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。

无菌接种步骤

1．将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。

2．材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1～2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。

3．用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程（以试管为例）是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1～3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外，其他尚无统一要求。接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。

褐化

解决方案：在培养基中添加活性碳可以防止植物组织自身的酚类物质排泌和变褐老化，对形态发生和器官形成有良好作用。一般认为，活性碳主要吸附非极性物质及色素大分子，可以减少一些有害物质的影响，但是具体吸附的选择性很差，温度低时吸附力增强，温度高时吸附力减弱，甚至会解吸附，通常使用浓度为0.5-10g/L。加入活性炭后使培养基变黑，对一些植物诱导生根有利。大量活性炭的加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加些琼脂。很细的活性炭容易沉淀，因此通常在琼脂将要凝固时，需轻轻摇动培养瓶。

酚污染

解决方案：植物外植体组织在接种时的切割面会溢泌一些酚类物质，在接触空气中的氧气后，其会氧化为相应的醌类物质，产生可见的茶色、褐色或黑色，此即谓“酚污染”。在木本植物，尤其是热带木本植物及少量草本植物中，此现象较为严重。

常用的防治措施如下

1、试用抗酚类氧化的药剂（半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、抗坏血酸等。该类药剂一般需用浓度为50-200mg/L。用经过滤灭菌的药液洗涤刚切割的外植体伤口表面，或加入固体培养基的表层，或将刚切割的外植体浸入其中一定时间）

2、适当降低培养基温度。

3、接种后先进行一定时间的暗培养。

4、及时转接入新鲜培养基。

5、选择切取外植体部位等。

初始培养阶段培养物的不良表现及改进措施

培养物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯

可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。

改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。

培养物长期培养几乎无反应

可能原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。

改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用2,4-D，调整培养温度。

愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状

可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。

改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。

愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢

可能原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。

改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。

侧芽不萌发,皮层过于膨大,皮孔长出愈伤组织

可能原因:枝条过嫩,生长素、细胞分裂素用量过多。

改进措施：减少激素用量，采用较老化枝条。

继代培养阶段培养物的不良表现及改进措施

苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高

可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。

改进措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改单芽继代为团块（丛芽）继代。

苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密集，微型化

可能原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。

改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。

分化率低,畸形,培养时间长时苗再次愈伤组织化

可能原因:生长素用量偏高,温度偏高。

改进措施：减少生长素用量，适当降温。

叶粗厚变脆

可能原因：生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。

改进措施：适当减少激素用量，避免叶片接触培养基。

再生苗的叶缘、叶面等外偶有不定芽分化出来

可能原因：细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再生方式。

改进措施：适当减少细胞分裂素用量，或分阶段地利用这一再生方式。

丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽

可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，温度过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空间窄。

改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照时间，增强光照，及时转接，降低接种密度，更换封瓶纸的种类。

幼苗淡绿，部分失绿

可能原因：无机盐含量不足，PH值不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例失调，光照、温度不适。

改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好PH值，调控温度、光照。

幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中

可能原因：瓶内气体状况恶化，PH值变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适，激素配比不当。

改进措施：及时转接、降低接种密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，控制温度。

生根阶段培养物的不良表现及改进措施

培养物久不生根，基部切口没有适宜的愈伤组织

可能原因：生长素种类、用量不适宜；生根部位通气不良；生根程序不当；PH值不适，无机盐浓度及配比不当。

改进措施：改进培养程序，选用适宜的生长素或增加生长素用量，适当降低无机盐浓度，改用滤纸桥液培养生根等。

愈伤组织生长过快、过大，根茎部肿胀或畸形，几条根并联或愈合

可能原因：生长素种类不适，用量过高，或伴有细胞分裂素用量过高，生根诱导培养程序不对。

改进措施：调换生长素种类或几种生长素配合使用，降低使用浓度，附加VB2或PG等减少愈伤，改变生根培养程序等。

组织培养作为一种生物技术，相比于扦插、嫁接的繁殖速度快，但所需要的条件也更为苛刻。

组织培养的优点

1、可进行无性繁殖。对一些生产上难以进行无性繁殖的花木，或者不能进行无性繁殖的花木，在组培的特殊条件下，可以在短期内获得大量营养苗。组织培养主要是利用无性生殖的原理，采取了植株的组织或细胞，然后进行大规模的培养。因此，它非常显著的优点是繁殖速度快，主要适合进行大规模的培育下一代植株。

2、组织培养能够保持母本的优良特性。也就是原本是又大又红又香的植株，组织培养出来的新植株，一定也会开出一模一样的花来，发生变异的可能性是微乎其微的。

3、组织培养能够通过人工去控制培养条件，不会被天气、季节能难控因素限制。因此它也具有生产效率高的优点，能够有效减少人力、财力的支出。

4、能保持原有品种的固有性状和特性。

5、节约繁殖材料。采集一小部分营养器官就能繁殖出大量苗木。

6、繁殖速度快。从优良母株上取一小块组织，在合适的条件下经过离体培养，一年内就能繁殖出成千上万株苗。

7、节省土地。组培材料是放在组培瓶或试管内培养的，通常一间30平方米的培养室就能摆放1万多个组培容器，可以繁殖几万株苗。而且周转快，全年均可连续培养。

8、去病毒。目前许多花卉病毒病较为严重，直接影响观赏和出口。通过组织培养技术借住一定的组培仪器设备可以进行脱毒，使之成为无毒的种苗。

9、复壮品种。对于长期使用无性繁殖，并开始退化的花卉品种，采用组培方法繁殖，可使个体发育向年轻阶段转化。

组织培养的难点

1、相比于传统的扦插、嫁接，组织培养需要具备的条件更高些，而且对设备也有一定的要求，培养时要保证无菌的环境，需要一定的投入，并不是随便在某个角落就能够轻松的完成的。

2、组织培养首先要准备合适的培养基，但是一种植株的品种很难找到合适的培养基，需要逐渐的实验筛选，有一定的周期。这也给组织培养的普及，带来一定的困扰。

3、组织培养最大的难点就是降低组培苗的污染率和提升组培苗移栽的成活率，组织培养虽然能够培养出很多幼苗，但是适应环境的能力还是有一定要求的，整体的技术和实践要求进而限制了组织培养的普遍应用。

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