胡昊/徐开寿/刘东团队揭示脑瘫的复杂分子病因学

脑性瘫痪（脑瘫）是婴幼儿中枢神经系统早期发育异常造成的运动障碍，其发病原因长期以来未能形成共识，以往认为的新生儿缺氧仅能解释不到10%病例，致病机理认识上的模糊造成脑瘫的诊断和治疗长期处于缓慢发展状态。近日，针对脑瘫病因学的最新研究成果以研究长文形式发表于国际权威神经病学期刊Brain（题：In-depth analysis reveals complex molecular aetiology in a cohort of idiopathic cerebral palsy），为这一问题的解答带来详实的依据。

该项研究历时五年，从120个家庭的122例特发性脑瘫病例入手，首先详尽调查其孟德尔遗传学和母系遗传学病因。作者发现，45%脑瘫患者带有致病变异，其中以生殖系错义点变异（germline missense SNVs）最为常见，其他类型生殖系变异包括无义点变异（nonsense SNVs）、插入缺失型变异（indels）和大片段拷贝数变异（CNVs）等均有检出。该研究首次揭示体细胞自发突变（postzygotic mutations）在脑瘫相关基因变异中占有一席之地，比例近7%，与其他神经发育性疾病如智力障碍（智障）和自闭症相似。就遗传模式而言，常染色体显性和隐性各占三分之一，余下的是X染色体连锁和线粒体基因组变异。值得注意的是，疾病相关基因变异的检出率与脑瘫症状的严重程度呈正相关；另外，脑瘫并发智障患者群体的检出率也显著高于单纯型脑瘫患者群体。这些发现为将来开展脑瘫患者的临床遗传学筛查提供了一定的方向性指导。

图1. 脑瘫研究队列的临床信息和遗传背景

接下来，作者汇总该项研究和以往文献报道结果，构建114个脑瘫相关基因数据库。通过比较后发现，约有一半脑瘫相关基因与智障相关基因重合，提示这两种疾病具有部分共通的分子机制。与智障相关基因相比，脑瘫相关基因的常染色体隐性遗传模式偏少，说明未来的脑瘫相关基因研究应当重点关注这一模式。基因功能分析发现，脑瘫相关基因富集在与脑发育密切相关的诸多模块里。很有意思的是，与病原微生物易感性有关的模块也出现富集，暗示脑瘫发病可能与对部分病原体的易感性有关。基因表达分析发现，脑瘫相关基因主要表达在控制运动和意识的各个脑区尤其是小脑、初级运动皮层和纹状体，主要细胞类型是浦肯野细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。作者还发现，脑瘫相关基因按照表达模式可分为两类，约有一半基因集中在前脑，时序表达高峰在胚胎期；而另一半基因集中在后脑，时序表达高峰在出生后。有意思的是，带有第一种类型基因有害变异的脑瘫患者往往也是智障患者，带有第二种类型基因有害变异的以单纯型脑瘫患者为主。这一发现首次创建脑瘫相关基因的二元分类学说，为脑瘫的分子病因学研究提供新的视角。基于这一学说，作者将两种类型脑瘫相关基因梳理后分别挑出一个代表性基因深入分析其致病机制，即TYW1基因和GPAM基因。

图2. 脑瘫相关基因的汇总分析

TYW1基因编码怀丁苷合成酶，怀丁苷作为苯丙氨酸tRNAUUU37位鸟苷酸的一种特殊修饰，能稳定密码子-反密码子配对，避免蛋白质翻译出现移框，以往文献未曾报道TYW1缺陷与人类疾病有关。作者从一个家庭的两个中重度脑瘫加智障患者的基因组中鉴定出TYW1基因复合杂合型有害变异。患者严重小头畸形，蛛网膜下腔隙加宽，提示脑部发育不良。作者构建斑马鱼基因敲低模型和小鼠基因敲除模型，成功模拟患者的小头畸形、意识和运动障碍，以及神经元增殖和迁移问题，并通过回补实验证明患者基因变异的有害性。由此作者推断TYW1基因缺陷是造成脑瘫患者临床症状的原因，随后为阐明具体作用机制，对小鼠模型开展深入研究。作者通过胎鼠EdU注射后的脑切片显色，证明Tyw1基因缺陷造成神经元增殖和迁移受阻。成年期小鼠脑切片免疫荧光染色发现，神经元迁移受阻导致大脑皮层浅层变薄而深层加厚，这一现象在额叶皮层和运动皮层均能观察到，与患者兼具脑瘫和智障两种症状相符。作者提取胚胎期小鼠大脑皮层原代神经元，通过EdU标记和TUNEL实验证明神经元数量减少是由于细胞增殖下降，而不是细胞凋亡上升。通过原代神经元穿孔实验，证明神经元迁移能力出现下降。随后，作者基于TYW1基因作用原理构建数学模型用于评估人、小鼠和斑马鱼胚胎发育时期脑蛋白质组受到的影响。计算机仿真发现有四种蛋白质受到的影响最为显著，即CENPE、STIL、NCAPD2和SASS6，让人吃惊的是，这四种蛋白质都与细胞周期密切相关，其缺陷均会导致原发型小头畸形。该结果得到qRT-PCR和WB实验验证，值得一提的是，Brain期刊审稿人高度评价这一机制研究，认为其简洁优美，逻辑性强。

图3. 脑瘫患者的临床表型和TYW1基因缺陷导致神经元增殖和迁移受阻的机制

第二类基因的代表GPAM编码脂代谢限速酶，对脂质合成有重要影响，迄今未有与人类疾病相关的报道。作者从一个重度脑瘫患者基因组中鉴定出GPAM基因复合杂合型有害变异，有意思的是，该患者智商高达116。患者脑部核磁共振常规扫描未现明显异常，但弥散张量成像（DTI）发现脑白质尤其是皮质脊髓束发育不良，这一结构是大脑运动皮层控制肢体运动的主要传导通道。作者通过斑马鱼模型和小鼠模型很好地模拟患者运动能力下降但无意识障碍这种特殊表型，并得出以下两个结论：1. Gpam基因缺陷直接影响的是星形胶质细胞，使其增殖受阻；2. Gpam基因缺陷导致运动皮层白质变薄和延髓皮质脊髓束的髓鞘发育不良。那么，第一个结论和第二个结论有什么关系？有文献报道，条件性下调少突胶质细胞的脂质合成会导致急性脱髓鞘病，众所周知，髓鞘是包裹在神经突触外的少突胶质细胞膜，其脂质含量远超一般细胞膜。让人意外的是，这种脱髓鞘病一段时间后能自行缓解，说明有其他脂质来源有效补充其脂质不足。近年来研究发现，星形胶质细胞是脑实质主要的脂质来源，不仅满足自身需求，还大量提供给神经元和少突胶质细胞。作者由此提出分子机制：GPAM基因在星形胶质细胞中参与脂质合成并输送给少突胶质细胞用于髓鞘形成，GPAM基因缺陷会造成持久的脱髓鞘病变，从而使皮质脊髓束功能受损。至于星形胶质细胞本身的增殖受阻，是由于GPAM酶反应的下游产物PA参与星形胶质细胞的细胞周期调控，这进一步影响了星形胶质细胞的脂质合成和输送。

图4. 脑瘫患者的临床表型和GPAM基因缺陷导致星形胶质细胞脂质代谢异常和髓鞘发育不良的机制

该论文第一作者是广州市妇女儿童医疗中心儿科研究所李娜副研究员、博士后周佩和方翔，以及康复科唐红梅和何璐，通讯作者是儿科研究所胡昊研究员和韩丁丁副研究员、康复科徐开寿主任，以及南通大学刘东教授。胡昊团队长期致力于儿童神经发育性疾病尤其是脑瘫和智障的病因学研究，工作成果相继发表于Nature，Brain，Molecular Psychiatry，American Journal of Human Genetics，PLoS Genetics，Journal of Medical Genetics，Human Mutation，Human Molecular Genetics等神经遗传学知名期刊。实验室诚挚欢迎同道者加盟，副研究员和博士后岗位长期开放，待遇从优。