我的第一个课题，差点败在了 qPCR 手里

上周领到了硕士生涯中的第一个小课题，用 qPCR 做病毒的绝对定量。

我一查文献，这个实验 so easy 呀。现成的标准品一稀释就上机了，一看曲线竟「无语凝噎」。毫无美感不说，做出来的标曲相关系数 R2 值才 0.86 ，计算出来的扩增效率 E 也才 78% 。这到底是啥情况？怪我功力不够深厚喽？

其实没有一项生物学实验是 so easy 的，即便是看起来毫无难度的 qPCR 。但同样地，任何一项生物学实验都是有套路的，包括 qPCR ，就看你套路深不深。

退火温度 Ta

对于像病毒载量这样的绝对定量实验来讲，标准曲线的质量起到决定性作用。R2 值太低一般是由于稀释操作不够准确，或者加样操作误差太大；E 值太低则可能是由于探针引物设计不够好，或者 Ta 值不合适；而 E 值太高则提示可能出现了非特异扩增或者 PCR 扩增受抑制的情况。根据 qPCR 的 MIQE 准则，合适的扩增效率 E 在 95%～105%，这就是努力的方向。

很多人会有疑问，为啥要千方百计的优化扩增效率呢？扩增效率的提高可以提升 qPCR 检测体系的灵敏度、动态范围，减少非特异性产物的产生；数据的重复性及可信度也会得到提高；Tm 值优化是提高扩增效率最直接最简单的方法，只需要一台具有温度梯度功能的 qPCR 设备即可，时间上还用不了半天。

Bio-Rad 的 qPCR 设备全系标配 8 个温度梯度功能（图 1），只要运行一次实验，就能找到最合适的退火温度条件。专利的蜂巢式反应模块，保证了很好的温度均一性，即使在较快的升降温过程中同样如此。

图 1. Bio-Rad 全系列 qPCR 仪均具有温度梯度模块，用于 qPCR 扩增程序的温度优化

优化温度梯度实验中，你只需要配好 8 个组分完全相同的反应体系（模板量适中即可）。在最后的结果中，能到得到最小 Cq 值的温度点即为最佳退火温度。通常，最佳的退火温度是狭窄的一个范围，而不是单一的温度点，比如图 2 中 57℃～58℃ 即为最佳的退火温度。对于染料法的 qPCR 体系，还要通过熔解曲线分析检查各退火温度下产物的特异性情况，首选没有非特异性扩增，且 Cq 值最小的退火温度为最适退火温度。

图 2. 不同的 Tm 值导致不同的扩增效率。数据来自于 Bio-Rad。

即使操作如此简单，很多实验者仍然会轻视。在此建议，将温度梯度优化纳入到预实验环节中，通过 qPCR 的温度梯度方法确认最佳的 Ta 值。

还要提醒大家，软件预测的引物和探针的 Ta 值仅用于参考，而且最佳 Ta 值会随着反应环境的变化而变化，预测的准确度并没有预期的那么高，因此不能盲目迷信，最佳的 Ta 值仍然要通过实验证据来确认。

扩增子、探针和引物

说完退火温度，再来聊聊扩增子的选取、探针和引物的设计，这也是扩增效率的重要影响因素。

扩增子是发生 PCR 反应的靶标基因片段。由于 qPCR 只是用于表征靶标基因的数量，并不需要得到其全长序列，因此扩增子区段的选择具有相当的灵活性，在基因读码框的内部即可（mRNA 的分析除外）。区段的选择一般遵循以下原则：

扩增子长度一般在 75～200 bp 范围。如果太长，扩增效率会降低；而太短又无法与引物二聚体区分开。

尽可能避免产生二级结构区域。这会极大的影响扩增效率。目前很多网站都可以在线预测二级结构，操作简单。

尽可能避免单碱基连续重复超过 4 次（如 AAAA、CCCC 等）。但有时在扩真核生物基因组时难以保证。

GC 含量尽可能在 50%～60%。这一点在扩增某些物种（如放线菌）基因组时同样难以保证。高 GC 模板扩增需要加入一些特殊成分来优化实验，目前也有商品化的试剂。

引物用于启始 PCR 反应，其质量直接关乎实验成败。引物设计一般遵循以下原则：

长度在 15～30 bp（一般为 18～25 bp），GC 含量尽可能在 50%～60%。严重的比例失衡会导致引物二聚体增多。

Tm 值在 50℃～65℃。过高会导致扩增受影响（DNA 聚合酶有一定的工作温度范围）；过低容易产生错配，特异性差。目前很多软件和网站可以预测引物的 Tm 值，要注意的是该值（包括引物合成单中的 Tm）仅仅是预测，并不代表实际情况，PCR 时最佳的退火温度需要通过温度梯度实验来得到。

避免匹配模板的二级结构区域。

避免连续出现三个以上 G 或者 C 碱基。引物中碱基分布最好是随机的，否则可能会在基因组中的 GC 密集区发生错误匹配。

3’ 端尽量安置 G 或者 C 碱基。GC 配对的强氢键作用对于启始 PCR 反应具有更好的作用。

避免引物二聚体的出现。其中包括自身配对和上下游引物配对，这要求 3’ 端序列尽可能不要出现大量碱基配对。

完整的探针包括荧光基团、淬灭基团和寡核苷酸序列三部分，理想的探针应该具有特异性高、荧光本底低等特点。对于寡核苷酸序列的设计一般遵循以下原则：

GC 含量 30%～80%，C 碱基要多于 G 碱基，长度一般15～30 bp。过长会影响淬灭效率，导致荧光本底较高；过短则导致特异性下降。

Tm 值一般比引物的要高 5～10℃。

5’ 端不能安置 G 碱基。G 碱基本身具有荧光淬灭的特性，会导致荧光基团被切掉后也无法发出荧光。

荧光基团根据检测的多重性灵活选择，一般首选常规的 FAM 和 HEX，同时针对不同的荧光基团选择合适的淬灭基团。淬灭基团一般首选 BHQ 系列（表 1）。

表 1. 荧光基团及对应的淬灭基团

总结

扩增子、探针和引物的科学设计是前提，温度梯度优化是必备的辅助手段，只有这样才能保证良好的扩增效率。Bio-Rad 提供完整的温度梯度优化方案，让你不再受制于扩增效率。与此同时，Bio-Rad 推出全新一代 qPCR 系统——CFX OPUS，在前代产品优良性能的基础上，对温度均一性进行了更好的优化，保证了板间数据的重复性。支持云端联网，为你数据的安全性保驾护航！可点击文末「阅读原文」了解更多详细内容。

* BIO-RAD 是 BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定区域的商标。

* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。

内容审核：刘果、周育红

题图来源：站酷海洛

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[4]. Jim F Huggett, Carole A Foy, Vladimir Benes, Kerry Emslie, Jeremy A Garson, Ross Haynes, Jan Hellemans, Mikael Kubista, Reinhold D Mueller, Tania Nolan, Michael W Pfaffl, Gregory L Shipley, Jo Vandesompele, Carl T Wittwer, Stephen A Bustin, The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments, Clinical Chemistry, Volume 59, Issue 6, 1 June 2013, Pages 892–902, https://doi.org/10.1373/clinchem.2013.206375

[5]. Real-time PCR Application Guide, Bio-Rad Bulletin 5279, 2006 Rev B