中伟团队建立新的肾脏类器官模型

责编 | 酶美

在器官移植手术中，超过80%的器官衰竭的病人需要更换的是肾脏，但是肾脏的捐献数量却远远赶不上肾脏的需求量。利用干细胞技术模拟肾脏的发育过程从而在体外人工合成可移植的肾脏为解决肾脏移植的供体短缺问题提供了新的思路，也是当前肾脏再生领域的研究热点。近年来，通过干细胞体外培养产生的具有三维结构的微型肾脏模型，即“肾脏类器官”，为肾脏发育、肾脏疾病致病机理研究以及肾脏再生提供了强大的工具【1-4】。哺乳动物的肾脏是由几千到上百万个肾单元以及与其相连的呈树状分支的收集管网络组成。这些肾单元过滤血液形成原尿，然后原尿再经由收集管网络重吸收调控身体的水、电解质、以及酸碱pH值的动态平衡，最终形成的尿液存储于膀胱并最终排出体外【5,6】。在胚胎时期的肾脏发育过程中，肾单元祖细胞（nephron progenitor）与收集管祖细胞（ureteric bud progenitor）相互诱导祖细胞的进一步分化和收集管的分支，最终形成复杂的肾单元-收集管网络结构【7,8】。作为肾脏的重要组成成分之一，收集管的发育缺陷可导致出生时肾脏缺失，肾脏畸形，肾单元数量减少，以及先天性肾脏和尿路畸形（CAKUT）【6,8,9】。目前的肾脏类器官模型已经可以产生一些类似于肾单元的结构【1-4】，但是高质量的肾脏收集管的类器官模型还没有建立，肾单元与收集管之间的连接也没有建立，这些缺陷很大程度上限制了从微型肾脏类器官模型向合成人工肾的飞跃。

针对上述肾脏再生领域的发展瓶颈，2021年6月15日，美国南加州大学凯克医学院博徳干细胞研究所李中伟组在Nature Communications杂志上发表题为Generation of patterned kidney organoids that recapitulate the adult kidney collecting duct system from expandable ureteric bud progenitors的研究论文。该论文首次报道了一个全新的三维培养方法，能够以类器官的形式对人和小鼠的原代收集管祖细胞，或者由人类多能干细胞 (hPSC) 分化而来的收集管祖细胞进行体外培养、扩增、并最终诱导分化为成熟的收集管。这个系统为利用干细胞合成人工肾提供了重要的集合管祖细胞作为元件；结合基因编辑技术，这套体外诱导的收集管类器官模型可以广泛的应用于肾脏发育和疾病机理研究。

李中伟博士在2016年首次报道了利用三维培养体系扩增肾单元祖细胞的方法【4】。采用相似的策略，该团队首先建立了原代小鼠收集管祖细胞的三维类器官体外培养/扩增条件。在此条件下，胎龄11.5天的小鼠收集管祖细胞可在体外生长及分支长达3周，细胞数扩增多达十万倍。通过qRT-PCR，immunostaining, RNA-seq等手段，作者发现这些体外培养的祖细胞可保持其祖细胞特性大约10天，与其在体内保持自我更新的时间基本一致。作者随后进一步筛选出了可诱导收集管祖细胞进行体外分化的条件。在这一条件下，经过七天的诱导可使这些未分化的收集管祖细胞类器官分化为成熟的收集管类器官。这种通过体外诱导而得到的收集管类器官拥有与成体肾脏收集管里两种主要的细胞类群，AQP2/3/4+ principal cell（PC）和FOXI1/ATP6V1B1+ intercalated cell（IC），并且PC和IC在类器官中的空间分布都与成体肾脏收集管类似。

左图：显微镜下的呈现分支状的新型肾脏集合管类器官模型。右图：新的肾脏集合管类器官模型能够在体外模拟成体肾脏的集合管的两类功能性细胞群：principal cell （红色）和intercalated cell （绿色）。

接下来，作者基于小鼠收集管祖细胞的培养条件，进一步筛选和调整之后，成功建立了人类原代收集管祖细胞三维类器官培养扩增体系。为了在再生医学上的应用，作者进一步建立了一套从人类多能干细胞定向分化而获得人类收集管祖细胞的方法。通过基因编辑技术，作者首先建立了带有双重集合管报告基因的多能干细胞系，然后基于这个报告基因系统，建立了人类多能干细胞分化为收集管祖细胞的方法。更重要的是，经过进一步的优化，作者建立了一套不依赖于报告基因的、能够从任何人类多能干细胞分化为收集管祖细胞的方法。这些由人类多能干细胞分化出的诱导收集管祖细胞与培养的原代细胞一样，都能在三维类器官培养体系中进行体外培养长达数月并扩增数百万倍，同时保持其进一步分化为人类集合管PC和IC细胞类群的能力。

为了展示这套新的类器官模型应用于发育和疾病研究的潜力，作者通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在小鼠以及人类集合管祖细胞类器官中敲除了受体蛋白基因Ret/RET。GDNF/RET信号通路在肾脏发育的过程中有着举足轻重的作用，其信号失活会导致先天性肾脏和尿路畸形（CAKUT）【6,8,9】。与此一致，敲除了Ret/RET的小鼠/人类类器官很快停止生长和分支，相关的下游基因表达也显著下降，而对照组（没有提供Cas9蛋白）则能够继续正常生长和分支。

最后，作者将体外培养的小鼠集合管祖细胞与体外培养数月的小鼠肾单元祖细胞团组装合并，制造出了合成肾脏（engineered kidney）类器官。与正常的肾脏发育过程相似，作者观察到了收集管祖细胞在肾单元祖细胞的诱导下继续生长和大量分支; 反过来，肾单元祖细胞在收集管祖细胞的诱导下分化为包含不同肾单元组成成分的管状结构。更重要的是，作者观察到这些形成的肾单元能够与收集管正确融合并形成统一的管道网络。这些数据表明了在体外培养扩增一段时间后，这两种肾脏的祖细胞依然保持了其在体内相同的分化潜能和功能性。这一实验结果为进一步利用肾单元祖细胞和集合管祖细胞人工合成肾脏提供了实验基础。

作为结构和组成最复杂的器官，肾脏的损伤和相关疾病一直是困扰人类健康的重大问题。李中伟团队的本项工作为研究肾脏的发育、疾病和再生提供了重要的类器官研究平台。这一系统将极大的推动肾脏的发育生物学和病理学研究，并为进一步的体外人工合成肾脏提供了关键的原材料。

美国南加州大学凯克医学院博徳干细胞研究所、肾脏研究中心博士研究生曾资鹏和博士后黄标博士为该论文共同第一作者。南加州大学凯克医学院博徳干细胞研究所、肾脏研究中心李中伟教授为该论文通讯作者。该课题得到了南加州大学凯克医学院博徳干细胞研究所的Andrew McMahon教授，肾脏研究中心的Kenneth Hallows教授以及Nuria Pastor-Soler教授等合作者的大力支持。

原文链接：

http://doi.org/10.1038/s41467-021-23911-5

实验室介绍：美国南加州大学李中伟实验室专注肾脏发育、疾病与再生研究，利用人类干细胞和类器官模型，小鼠模型，基因编辑技术，结合单细胞组学、功能基因组学研究肾脏的发育机制，建立肾脏的疾病模型并进行药物筛选。实验室的长远目标是利用干细胞和工程技术在体外合成可移植的肾脏。欢迎对相关方向感兴趣的研究生、博士后以及访问学者加入本实验室 (http://lilab.usc.edu)。实验室的集合管祖细胞类器官以及成熟集合管类器官的技术平台可以广泛应用于药物的肾脏毒理测试，肾脏疾病模拟和药物筛选。相关技术已经申请专利，目前处于专利授权前的技术验证阶段。对此技术平台的专利授权感兴趣的朋友可以联系。

简历投递（有意者请将个人简历等材料发至）：

https://jinshuju.net/f/ZqXwZt

参考文献

1 Taguchi, A. et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.Cell Stem Cell14, 53-67, doi:10.1016/j.stem.2013.11.010 (2014).

2 Takasato, M. et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.Nature526, 564-568, doi:10.1038/nature15695 (2015).

3 Morizane, R. et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.Nat Biotechnol33, 1193-1200, doi:10.1038/nbt.3392 (2015).

4 Li, Z. et al. 3D Culture Supports Long-Term Expansion of Mouse and Human Nephrogenic Progenitors.Cell Stem Cell19, 516-529, doi:10.1016/j.stem.2016.07.016 (2016).

5 Costantini, F. & Kopan, R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.Dev Cell18, 698-712, doi:10.1016/j.devcel.2010.04.008 (2010).

6 Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.Wiley Interdiscip Rev Dev Biol1, 693-713, doi:10.1002/wdev.52 (2012).

7 Little, M. H. & McMahon, A. P. Mammalian kidney development: principles, progress, and projections.Cold Spring Harb Perspect Biol4, doi:10.1101/cshperspect.a008300 (2012).

8 McMahon, A. P. Development of the Mammalian Kidney.Curr Top Dev Biol117, 31-64, doi:10.1016/bs.ctdb.2015.10.010 (2016).

9 Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H. & Knoers, N. V. Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT.Nat Rev Nephrol11, 720-731, doi:10.1038/nrneph.2015.140 (2015).