产低温蛋白酶动性球菌的筛选及其在低盐鱼露发酵中的应用

鱼露是一种很受欢迎的传统发酵调味品，有独特的风味和口感。传统鱼露的生产通常以低值鱼虾为原料，混入质量分数30%的食盐，在鱼体自身的酶和嗜盐微生物的共同作用下，发酵数月制得。盐添加量、温度、添加酶或产酶微生物等工艺是影响鱼露风味的主要因素，因此，为了缩短生产周期，保温发酵、外加酶发酵和外加曲发酵等技术陆续被开发出来，但鱼露产品仍然存在高盐的弊端。

温度是影响发酵过程中微生物的生长和酶的产生的重要参数之一。嗜冷菌通过产生冷适应酶生存，这种酶具有应对低温引起化学反应速率降低所需的特性。低温蛋白酶通常是指最适催化温度在40 ℃及以下的一类蛋白水解酶。在中低温条件下，嗜冷酶有更高的活性，并且与嗜中温酶相比，嗜冷酶能够在较低的温度下被灭活。这些性能对于工业应用非常有益。江苏大学食品与生物工程学院的周 晶、袁 丽、高瑞昌*从传统虾酱中筛选并鉴定4 株动性球菌，进而探索其作为起始发酵剂应用与低盐鱼露生产的可行性。

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产蛋白酶菌株的筛选和鉴定

通过在添加脱脂乳粉琼脂平板上观察水解透明圈的方法，成功从传统发酵虾酱中筛选并分离出4 株有较高蛋白酶活力的细菌。因为在细菌菌落周围产生了清晰的水解圈（图1），这4 株菌被鉴定为蛋白酶产生菌即XJ2、XJ10、XJ11和XJ12。在蛋白酶活力检测中，与其他菌株相比，XJ11有最高的蛋白酶活力（（10.07±0.11）U/mL，P＜0.05，表1）。革兰氏染色分析表明，4 株菌均为革兰氏阳性球菌。

使用序列分析软件MEGA进行核酸序列比对，进一步构建系统发育树。在16S rRNA基因分析的基础上，利用BLAST搜索技术对4 株菌序列进行系统描述和亲缘关系鉴定。系统发育树分析表明，菌株XJ2、XJ10、XJ11和XJ12分别落在P. maritimus CP016538菌群、P. plakortidis CP016539菌群、P. dechangensis JQ762282菌群以及P. rifietoensis CP013659菌群中（图2）。因此，将这4 株菌分别命名为P. maritimus XJ2、P. plakortidis XJ10、P. dechangensis XJ11和P. rifietoensis XJ12。

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菌株的生长特性

由图3a可知，当温度为5～25 ℃时，细胞密度随温度的增加呈现升高的趋势；当温度高于25 ℃时，细胞密度有下降的趋势。当温度为15 ℃时，菌株有最快的生长速率，这也就表明动性球菌能在低温条件下较快生长。环境中的pH值变化会对细菌的生长产生重要的影响，主要是影响细菌对营养物质的解离与吸收。图3b显示，当初始pH值为7～8时，测得的细胞密度最高，因此动性球菌为中性偏碱性细菌。当NaCl质量分数大于15%时菌株几乎不生长；当NaCl质量分数为0%～15%时，细胞密度随NaCl质量分数的增加而降低（图3c）。基于此，本实验认为动性球菌不属于嗜盐菌，但具有一定的耐盐性。在最优的生长条件下，测得动性球菌的生长曲线（图3d）。16～48 h为动性球菌的指数生长期，即细胞密度快速增长的阶段，了解生长曲线有助于准确掌握接种时间，从而加快发酵速率。

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粗蛋白酶酶学特性

温度、pH值和NaCl质量浓度对产酶的影响较大。在优化温度的实验中，动性球菌所产的粗酶在10～60 ℃的温度范围内有活性，在40 ℃时检测到蛋白酶的最大活性（图4a）。与南极嗜冷杆菌Ta41的蛋白酶S41（-2～4 ℃）和嗜盐古生菌Halogranum rubrum的耐盐蛋白酶（50 ℃）相比，动性球菌的蛋白酶具有更好的冷适应能力。在不同缓冲体系pH 3.0～11.0范围内，测定了pH值对蛋白酶活性的影响。结果（图4b）表明，该蛋白酶在7.0～11.0的较宽pH值范围内具有活性。pH值为9.0时，动性球菌XJ2、XJ10和XJ12所产的蛋白酶活性最高，说明所产的酶是一种碱性蛋白酶，这与来自其他微生物的碱性蛋白酶也有相同的pH值范围。如图4c所示，蛋白酶在NaCl质量浓度为0～15 g/100 mL时有活性，在15 g/100 mL时活性最低。尽管蛋白酶在高盐浓度下有所降低，但当NaCl质量浓度为1～9 g/100 mL时仍有较高的酶活力，因此该蛋白酶在一定程度上具有耐盐性。

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AAN和TVB-N含量

在发酵的最后阶段（15 d，图5），A组中的AAN质量浓度（1.33±0.08）g/100 mL明显高于B组（（0.89±0.02）g/100mL，P＜0.01）。有报道指出，发酵2 a的传统鱼露的AAN质量浓度可达到（1.10±0.03） g/100 mL。在降低温度和NaCl质量分数的同时仍然能够保证鱼露的质量，这主要归功于采用动性球菌作为起始发酵剂。与发酵剂Staphylococcus sp. CMC5-3-1相比，本实验的发酵时间从180 d降低至15 d，加盐量从25%降低至8%。根据以上的AAN结果，可以得知在发酵过程中添加动性球菌发酵剂能够有效增加鱼露中AAN含量。TVB-N是反映鱼露腐坏程度的主要指标，随发酵时间的延长，2 组样品的TVB-N值均呈现上升的趋势。发酵15 d后，B组TVB-N质量浓度达到（209.00±1.49）mg/100 mL，然而A组TVB-N质量浓度（170.00±1.05）mg/100 mL明显低于B组（P＜0.05）。结果表明，发酵剂（动性球菌）可以抑制腐败微生物的生长，从而降低TVB-N含量。因此，动性球菌可以作为一种新型的起始发酵剂，不仅能够在低温发酵条件下有较高的酶活力和发酵效率，还能够提高AAN含量并有效降低TVB-N含量。

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挥发性风味物质分析

结果可知，其中7 类挥发性化合物通过固相微萃取-气相色谱-质谱方法在低盐鱼露中被检测出来，包括6 种醇类、4 种酸类、11 种醛类、6 种酮类、4 种酯类、6 种烷烃类和2 种吡嗪类，与传统发酵法相比（18 种），此法获得的挥发性风味物质更加丰富。发酵鱼产品特殊的风味主要来自于这几类典型挥发性风味物质，与前人的研究基本保持一致。醛类是鱼露中最丰富的挥发性风味物质，因醛类阈值较低，因此对鱼露整体风味的形成有较大的贡献。风味物质中醛类大多数来源于不饱和脂肪酸的氧化。与B组相比，A组中己醛含量较高，其中己醛是亚油酸氧化的产物，具有青草香味。A组中庚醛含量明显低于B组和C组，庚醛则是被证实的一种鱼腥味物质。异戊醛和苯甲醛都属于支链醛，来源于氨基酸的降解，能够赋予鱼露杏仁和水果香味。A组中2-甲基丁醛和3-甲基丁醛含量均高于B组，这2 种物质被认为是鱼露中最重要的挥发性醛并且对麦芽和坚果气味有贡献。因此，接种了发酵剂（动性球菌）的鱼露样品产生了更加强烈的青草、麦芽和坚果气味以及降低了鱼腥味。

结 论

本研究从传统发酵的虾酱中分离得到4 株产低温蛋白酶的菌株，经菌种鉴定分别为P. maritimus XJ2、P. plakortidis XJ10、P. dechangensis XJ11和P. rifietoensis XJ12。4 株动性球菌可在15～25 ℃进行快速生长代谢并且具有分泌低温蛋白酶的能力。酶学性质分析结果显示：动性球菌所产蛋白酶的最适温度为40 ℃，最适pH值为9.0，并且当NaCl质量浓度小于9 g/100 mL时有较高的酶活力。研究结果表明，利用所筛选的动性球菌作为起始发酵剂在低盐鱼露的生产中具有一定的可行性和优越性。动性球菌在低温发酵条件下具有较高的酶活力和发酵效率，促进鱼露典型特征风味物质的生成且降低鱼腥味，能够有效产生传统鱼露的典型风味，降低传统发酵的盐浓度。本实验得到的4 株动性球菌可作为一种有效的低盐鱼露发酵剂。

本文《产低温蛋白酶动性球菌的筛选及其在低盐鱼露发酵中的应用》来源于《食品科学》2021年42卷8期122-128页，作者：周晶，袁丽，高瑞昌。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200314-220。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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