Introduction
灵芝（Ganoderma lucidum）的干燥子实体被用作食品和传统中药已有1000多年历史。在中国和其他东方国家，灵芝是一种广泛使用的膳食补充剂和药材。它是世界上使用最多的药用真菌之一。在过去，灵芝被视为促进健康和长寿的灵药。它具有广泛的生物活性，包括抗微生物、免疫调节、抗癌、抗炎、抗氧化和降血糖。目前，灵芝已被用于预防和治疗各种疾病，如癌症、肝病、高血压和糖尿病。对各种疾病的治疗是由于各种活性化合物，如三萜类、多糖、甾醇、生物碱、核苷酸、蛋白质和凝集素。
迄今为止，已从灵芝中分离并鉴定出150多种三萜类化合物，如灵芝酸A、B、C、D和AM1是主要的药用成分。因此，这些三萜类化合物被用来作为评价灵芝质量的代表成分。
中药的治疗效果是基于复杂的化学成分作为一个整体系统的相互作用，所以需要控制这个复杂系统的质量。在这种情况下，关键成分的HPLC指纹图谱为中药的质量控制提供了一种新的方法。在指纹分析的高级阶段，通过数理统计和分析，将特征峰的指纹与药效学的结果联系起来，从而明确中药疗效的物质基础，建立真正反映中药内在质量的评价方法。
河南大学国家食用菌加工技术研发专业中心的Changqin Li、Yiping Cui、Zhenhua Liu、Wenyi Kang，河北省食品检验研究院的Yan Zhang等，在本文建立了准确的光谱效应关系，揭示了灵芝中增强免疫力的有效成分之间的相互作用。通过高分辨液相色谱质谱联用技术对关键色谱峰进行了鉴定，确定了以提高免疫力的成分作为灵芝中的活性指标化合物，可提高灵芝的质量标准。
Results and Discussion
色谱峰的定量测定
HPLC具有分离效率高、检测灵敏度高、分析速度快、选择性强、应用范围广等特点。因此，中药的大部分成分都可以用HPLC来检测和分析。
色谱图必须对所有样品具有代表性，并具有完整性和模糊性的特点。通过分析色谱图的相互模式，即使某些化学成分的含量与其他成分不同，也能很好地进行样品的鉴定和认证。
采用中药色谱指纹相似度评价系统（2004，1.0 A版）对色谱峰进行定量测定。根据色谱峰，对色谱峰位置进行多点校正。通过平均法生成对比色谱图。匹配的色谱图如图1所示。
图1 S1～S14样品的重叠HPLC色谱图
灵芝的免疫活性
药效学的有效信息是通过体外或体内的实验模型获得的。巨噬细胞在先天免疫中起着重要作用。当人体免疫力低下时，需要外来药物来刺激先天和后天免疫反应。选择RAW264.7细胞作为免疫学研究模型是因为RAW264.7细胞在体外培养时可以刺激体内巨噬细胞的免疫反应。
从图2可以看出，与空白对照组相比，阳性对照组LPS明显增加了RAW264.7细胞释放NO的能力（P＜0.001）。灵芝中S1、S2、S3、S4、S5、S6、S9、S11和S12的提取物在200 μg/mL的浓度下可以明显增加RAW264.7细胞释放的NO含量，从而提高巨噬细胞的免疫调节功能，差异明显（P＜0.001）。
图2 14种灵芝提取物在RAW264.7细胞中释放的NO含量
人工神经网络（ANN）模型的建立
传统的多变量统计建模方法不能反映中药谱系效应之间的复杂非线性关系，所以很难准确预测中药的疗效。因此，它不能评价中药的内在质量。BP神经网络可以处理非线性、模糊、随机、低精度和大通量信息。它的非线性拟合能力可以解决复杂的模式识别问题，如知识背景不清楚、推理规则不清楚等。因此，本研究采用BP神经网络对复杂化合物的指纹与生物活性进行关联分析，以进一步明确光谱效率关系。
当隐藏层节点数为12时，训练后的模型具有最小均方误差（MSE）和最大的相关系数（R）。因此，选择12个神经元来实现神经网络模型的最佳性能。在图3中，显示了最佳ANN模型的MSE与历元数的关系图。图4显示了不同阶段隐藏层节点的最佳数量下，实验和预测结果的比较。代表模型和实验数据之间拟合度的线性R为0.98643。这些结果表明，BP神经网络模型具有较高的预测精度和良好的泛化能力，可用于免疫功效值的预测。
图3 MSE与历元数的关系图
图4 BP神经网络模型参数
成分鉴定
与负离子模型相比，正离子模型更适合于灵芝中化合物的鉴定。通过对敲除成分的高分辨质谱分析，以及参考分子离子峰和离子碎片的对比数据，确定化合物的结构和分解途径。详细结果如图5所示。
a. 葡糖酸N；b. 灵芝酸B；c. 灵芝酸A；d. 葡糖酸A；e. 灵芝酸D；f. 灵芝酸J。
图5 敲除的成分和建议的裂解途径
基因敲除成分和阴性样品对RAW264.7细胞中NO产生的协同/拮抗作用
在图6a中，P24、P30、P38、P42和P43的目标成分抑制了RAW264.7细胞上释放的NO含量，而阴性样品则增加了NO含量。然而，目标成分和阴性样品的NO含量之和高于原始溶液的含量。这种现象可能是由于阴性样品中存在抑制RAW264.7细胞中NO产生的成分。这些成分在抑制RAW264.7细胞中NO的产生方面起到了协同作用。
图9b中，P12、P14、P16、P18、P19、P21、P22、P26、P28、P46及其阴性样品的目标成分可以增强免疫力，与原液一致。这些目标成分和阴性样品RAW264.7细胞的NO含量之和高于原液。这表明，被敲除的目标成分与其阴性样品之间可能存在着拮抗作用。
a. 协同作用；b. 拮抗作用。
图6 分析灵芝提取物和阴性样品之间的协同和拮抗作用
Conclusion
本文通过PLSR建立了灵芝的光谱效应关系，并利用BP神经网络建立了光谱和效应的组合模型来预测免疫功效值。采用成分敲除法和UPLC-MS/MS法测定具有免疫活性的化合物，阐明了灵芝免疫学活性的物质基础。
最后，通过高分辨质谱法将P14、P16、P18、P22、P24、P26、P28和P30鉴定为葡糖酸N、灵芝酸B、灵芝酸A、葡糖酸A、灵芝酸D和灵芝酸J。当样品的浓度200 μg/mL时，葡糖酸N、灵芝酸B、灵芝酸A和灵芝酸D是灵芝中激活RAW264.7细胞的活性成分。葡糖酸A和灵芝酸J是灵芝中抑制RAW264.7细胞的活性成分。
本研究以灵芝指纹图谱的共同峰面积和免疫功效指数为样本训练BP神经网络，建立了灵芝指纹图谱功效的综合评价体系。BP网络模型的R值为0.98643。药效预测结果表明，该模型是可靠的，误差在理想范围内。建立了灵芝光谱功效组合的评价体系。
Spectrum-effect relationship of immunologic activity ofGanoderma lucidum by UPLC-MS/MS and component knock-out method
Changqin Lia,b,c,1, Yiping Cuia,b,c,1, Jie Lua, Lijun Menga, Changyang Maa,b,c, Zhenhua Liua,b,c,*, Yan Zhangd,*, Wenyi Kanga,b,c,*
a National R & D Center for Edible Fungus Processing Technology, Henan University, Kaifeng 475004, China
b Functional Food Engineering Technology Research Center, Henan Province, Kaifeng, 475004, China
c Joint International Research Laboratory of Food & Medicine Resource Function, Henan Province, Henan University, Kaifeng 475004, China
d Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050091, China
1 These authors contributed equally to this work.
*Corresponding authors.
E-mail address: liuzhenhua623@163.com
snowwinglv@126.com
kangweny@hotmail.com
Abstract
This study was designed to elucidate the immunoregulation of Ganoderma lucidum. HPLC fingerprint and spectrum-effect relationship of G. lucidum were established to predict the active compounds and BP neural network model was established to predict the efficacy. Then the target compounds were identified by high resolution mass spectrometry. The results indicated that there are both enhanced immunity and immunosuppressive components in G. lucidum. BP neural network was trained with the common peak area and immune efficacy index of G. lucidum fingerprint as samples, and a combined evaluation system of G. lucidum fingerprint efficacy was established. The correlation coefficient R of BP network model was 0.986 43, and the error of pharmacodynamic prediction results was in the ideal range. Eight compounds were identified by high resolution mass spectrometry. The compounds related to immune activity in G. lucidum were determined in this study.
该文章《Spectrum-effect relationship of immunologic activity of Ganoderma lucidum by UPLC-MS/MS and component knock-out method》发表于Food Science and Human Wellness 2021年第3期278-288页。点击下方阅读原文即可查看摘要原文。
翻译：梁安琪；编辑：袁艺；责编：张睿梅
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