石榴酒发酵过程中真菌种群演替及风味物质代谢规律解析

近年来石榴酒成为国内外均颇为流行的新型果酒。石榴酒的发酵工艺通常参考葡萄酒的发酵工艺，在采摘、运输、破碎及榨汁等环节会带入石榴表皮及环境中的多种酵母、霉菌及细菌等多种微生物都会进入石榴酒发酵过程中。这些微生物在发酵过程中产生多种代谢物质，影响石榴酒的风味、安全及产品质量稳定性。然而目前国内外对石榴酒发酵过程中微生物的种群演替规律及其代谢特征均不清晰。目前国内外鲜见关于石榴酒发酵过程中土著微生物的研究，因此目前亟需解析石榴酒发酵过程中参与的微生物以及这些微生物在发酵过程中发挥的作用。

山东省石榴精深加工工程技术研究中心、山东省石榴资源综合开发工程实验室、枣庄学院食品科学与制药工程学院的彭潇、邹文静以及王雪山*和北京工商大学食品质量与安全北京实验室的李贺贺*等人结合高通量测序及GC-MS解析石榴酒发酵过程中土著微生物种群演替规律及其对石榴酒风味成分的贡献，以期为石榴酒发酵工艺优化、提升产品品质提供理论基础。

1 石榴酒发酵过程中风味物质变化规律

通过GC-MS从15 个石榴发酵液样品中共检测到65 种挥发性化合物，包含11 种醇类、6 种酸类、28 种酯类、13 种芳香族物质、4 种酮类和3 种含硫化合物（图1）。PCA显示石榴酒中风味物质随着发酵时间呈现明显的变化（图2）。PC1可解释发酵过程中风味物质变化的60%，发酵前4 d在其中起主要作用。PC2仅解释风味成分变化的12.3%，主要由发酵4～25 d引起。这表明发酵前4 d是石榴酒中风味物质形成的最关键时期。

图3显示未发酵的石榴汁中共检测到40 种物质，主要包含乙酸异戊酯（348.34 μg/L）、乙酸乙酯（576.53 μg/L）及乙酸苯乙酯（209.43 μg/L）等物质。其中乙酸乙酯（菠萝香、苹果香、水果香）也是Mollar de Elche石榴汁中的主要风味物质，但是乙酸异戊酯（香蕉香、甜香、苹果香、水果糖香）及乙酸苯乙酯（玫瑰花香、花香）在Mollar de Elche石榴汁中含量很低。这可能是因为石榴品种差异导致其中风味物质含量不同。然而随着发酵过程的进行，正己醇、3-己烯-1-醇、乙酸异戊酯等物质含量逐渐降低，其中蘑菇醇、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、2,3-戊二酮、烯丙基甲基硫醚等12 种物质仅能在未发酵石榴汁中能检测到（图1、3）。而异戊醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇等物质含量随着发酵时间增加。

发酵结束时，石榴酒样品中共检测到53 种挥发性化合物，其中异丁醇、草酸、月桂酸乙酯、癸酸异戊酯、乙烯基1-丁硫醚等25 种物质仅在发酵结束的石榴酒中能检测到（图1、3）。这表明，发酵过程可以增加石榴酒风味成分及风味特征的多样性，对石榴酒的风味特征形成起到至关重要的作用。

2 石榴酒发酵过程中真菌种群演替规律

通过高通量测序检测石榴酒发酵样品，共检测到1 006 014 条高质量序列，平均每个样品67 068 条序列，其中序列最少的样品含有42 372 条序列。稀释曲线（图4）显示，在42 372 条序列水平下，每个样品曲线都趋于平稳，说明此测序深度能够满足分析石榴酒真菌种群的需要。

多样性指数分析发现，随着发酵的进行，石榴酒中真菌种群多样性呈现先降低，后升高的现象。其中发酵第4、8天时，样品的Shannon指数、Simpson指数均显著低于未发酵时，而在发酵第15天后，样品真菌种群多样性呈回升趋势。NMDS分析显示石榴酒的发酵过程中可分为3 个阶段，结果显示0～4 d是真菌种群结构变化最主要的阶段，而4～8 d真菌种群结构比较接近，发酵8 d之后种群结构的变化，可能由于发酵温度调整为10 ℃，微生物种群结构发生了应激调整（图5）。

所有样品中共检测到58 个真菌属，其中酵母属（Saccharomyces）、有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）及曲霉菌属（Aspergillus）在所有样品中平均相对丰度大于1%，是石榴酒发酵过程中的优势真菌种群（图6）。有孢汉逊酵母属是石榴汁中的主要酵母种群，占总真菌种群相对丰度的57.84%～60.13%，其次是酵母属（7.02%～8.62%）、毕赤酵母属（4.48%～6.37%）及假丝酵母属（1.64%～1.94%）。发酵第4天时，发酵液中酵母属相对丰度增加至94.17%～97.26%，其中最主要的OTU是酿酒酵母，其他非酿酒酵母及霉菌的相对丰度则显著降低。同时，4～8 d时酿酒酵母是发酵体系中绝对优势菌种，其主要作用是产生乙醇，说明这一时期也是发酵过程中产醇的主要阶段。发酵8 d之后，酿酒酵母相对丰度降低，非酿酒酵母相对丰度升高，这可能是由于8 d之后发酵温度降为10 ℃。以往关于葡萄酒的研究表明，有孢汉逊酵母、毕赤酵母及假丝酵母等非酿酒酵母可代谢产生多种芳香族物质及单萜类物质，可增加葡萄酒的水果香气。而石榴酒发酵这一阶段中这些非酿酒酵母丰度的增加同样可能是石榴酒中芳香族化合物等风味物质增加的主要原因（图1），这同时也表明适度的低温发酵有利于非酿酒酵母繁殖，有利于增加石榴酒的风味多样性。

3 石榴酒发酵过程中真菌种群与风味化合物之间相关性分析

为了进一步研究发酵过程中真菌种群对石榴酒风味成分的贡献，本研究应用Granger因果关系法分析了主要真菌种群与风味物质之间的时间相关性。Granger因果关系是经济学领域中的一种重要方法，可以利用时序性数据分析其中因果关系。与Pearson相关性、Spearman相关性等分析不同的是，Granger因果分析具有方向性，因此近年来Granger因果关系逐渐被用于肠道微生态、水体微生态等研究中。

石榴酒发酵过程中真菌种群是风味物质的主要来源之一。异丁醇和异戊醇是石榴酒中主要的高级醇类物质，又称为杂醇油。一定量的高级醇可以增加酒的醇厚感，但是含量过高则会导致酒容易上头。图7表明，酿酒酵母与假丝酵母均与异丁醇和异戊醇呈现Granger因果关系。因此，本研究中异丁醇和异戊醇在发酵中后期大量产生，可能主要是由酿酒酵母代谢石榴汁中支链氨基酸产生的。乙酸乙酯及月桂酸乙酯是石榴酒中的主要酯类物质，可以增加石榴酒的水果香及花香。同时，图7显示酿酒酵母、有孢汉逊酵母、毕赤酵母及假丝酵母对这两种酯类均呈Granger因果关系。因此，推测石榴酒中乙酸乙酯及月桂酸乙酯代谢可能也与毕赤酵母有关。此外，图7显示发酵过程中的草酸、异丁酸、辛酸等酸类物质同样对发酵体系中的酵母种群有一定作用。

结 论

本研究应用高通量测序系统解析了石榴酒发酵过程中真菌种群演替规律，发现酵母属、有孢汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属及曲霉菌属是石榴酒发酵过程中的优势真菌种群。结合代谢组学及统计学手段表明这些微生物对石榴酒中异丁醇、异戊醇等高级醇类，乙酸乙酯、月桂酸乙酯等酯类物质有较强贡献。本研究为深入挖掘石榴酒功能微生物，提高石榴酒产品质量及稳定性提供理论基础。

本文《石榴酒发酵过程中真菌种群演替及风味物质代谢规律解析》来源于《食品科学》2021年42卷6期157-163页，作者：彭潇，邹文静，邵清清，孙中贯，张立华，李贺贺，王雪山。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200114-163。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网

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