卵白蛋白-白藜芦醇相互作用机理及其对卵白蛋白的影响

　　鸡蛋是常见八大食物过敏原之一，鸡蛋过敏原蛋白主要存在于蛋清中，其中卵白蛋白（OVA）占蛋清中蛋白含量的54%，是鸡蛋中过敏原蛋白含量最高的一种蛋白质。过敏原的抗体结合表位是过敏原蛋白上可被机体识别并产生一系列免疫反应的位点，一般分为线性表位和构象表位。因此，在脱敏/低致敏蛋制品研究领域，研究人员常采用一些加工手段对过敏原的线性表位和构象性表位进行改造以达到降低/完全消除致敏性的目的。

　　近年有较多活性物质与蛋白质相互作用的研究，活性物质与蛋白质相互作用一方面可提高活性物质的吸收率、生物利用率，另一方面改善蛋白质的加工特性、潜在致敏性。现有研究表明多酚类物质可与花生蛋白、牛奶蛋白等过敏原蛋白相互作用，蛋白质的氨基酸微环境、高级结构（二、三、四级结构）都可能受到影响，从而改变过敏原蛋白的线性表位、构象表位，起到降低过敏原蛋白致敏性的作用。白藜芦醇（RES）是一种非黄酮类多酚化合物。RES作为膳食补充剂与鸡蛋中主要过敏原OVA的相互作用及其对OVA潜在致敏性产生的影响仍不清楚，需要进一步的研究阐明。

　　南昌大学食品科学与技术国家重点实验室的操强、佟平*和南昌大学食品学院的胡巍等人以RES和OVA为研究对象，利用荧光光谱法探究OVA和RES相互作用的机理，且从体外血清学角度评价OVA-RES复合物的潜在致敏性。本研究旨在指导开发具有丰富活性且低致敏或脱敏的蛋制品，为人们的日常健康膳食提供理论依据。

　　1相互作用机理

　　常用荧光光谱法研究蛋白质的结构。如图1A～C所示，在298、306、314 K条件下，固定激发波长280 nm，随着RES的加入，OVA的荧光强度有明显减弱，且各温度下都表现出不同程度的红移现象。由此可得RES和OVA发生了相互作用，RES的加入使得蛋白质的Trp等残基微环境发生了改变。

　　图1D中3 条曲线分别是298、306、314 K条件下，以RES浓度为横坐标、F 0 /F为纵坐标拟合的Stern-Volmer曲线；荧光猝灭类型一般分为动态猝灭和静态猝灭，由图1D可知，猝灭曲线和RES浓度有良好的线性关系，而且Stern-Vlomer斜率随着温度升高而增大，即猝灭常数K SV 随温度升高而增大，由此可以判断RES对OVA的荧光猝灭类型为分子间碰撞而引起的动态猝灭。

　　RES相对分子质量为228.24，是一种多酚类小分子物质。小分子物质在与生物大分子蛋白质相互作用时，可能存在一个平衡状态，即部分小分子与蛋白结合，而另一部分处于游离状态，因此通过如下双对数方程描述这种平衡关系；结果显示，298、306、314 K条件下，OVA-RES的结合常数分别为1.53h 10 4 、0.55h 10 4 、0.20h 10 4 L/mol，而结合位点数分别为0.964 8、0.820 3、0.739 7，说明RES与OVA结合的最佳比例约为1∶1。

　　经计算RES和OVA相互作用热力学参数信息，结果显示，ΔH＜0，ΔS＜0，可以确定RES与OVA的相互作用力主要是氢键和范德华力，该结果与另一类似研究结果相同。这可能与RES含有多个酚羟基有关，酚羟基是较强的极性基团，可与侧链带羟基的氨基酸（例如丝氨酸、苏氨酸）形成氢键，而OVA中丝氨酸和苏氨酸数量之和占全蛋白氨基酸总数的13.73%。

　　2同步荧光光谱

　　在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm时OVA的同步荧光光谱，分别表示RES对OVA的Tyr和Trp残基微环境的影响。从图2可知，荧光强度都随着RES浓度增大而减小，其中Δλ=15 nm时，荧光光谱表明RES对OVA的Tyr残基的吸收峰最佳吸收波长有所影响，发生了明显蓝移，从原来的297 nm变为296 nm，这可能是因为RES的添加导致Tyr所处微环境的极性减小；当RES添加量达到3.92 μmol/L时，最强吸收峰值强度变化为20.78%，这表示蛋白质构象可能发生了明显变化；而Δλ=60 nm时，光谱显示最佳吸收波长无明显移动，RES对OVA中Trp微环境影响较Tyr的弱，当RES添加量为3.92 μmol/L时，荧光最强吸收峰值荧光强度变化为13.65%。此外，因为RES的添加对Tyr和Trp的微环境影响不一，这说明RES与OVA相互作用时，RES与两种氨基酸的作用距离可能有所不同。

　　3三维荧光光谱

　　结果显示，RES对OVA的三维荧光光谱荧光强度有所影响，其中峰a是Trp和Tyr的特征峰，在三维荧光光谱中表征蛋白质的三级结构，而峰b表征的是蛋白质的多肽链骨架，即二级结构。随着RES的添加，OVA的峰a的峰高明显降低，峰高从原来的876.8减小为805.6和745.1，但是峰位置无明显变化，然而表征二级结构的峰b的峰高、峰位置皆有变化，峰b从原来的（230 nm/335 nm）红移为（235 nm/340 nm），以上信息都表明RES对OVA的氨基酸微环境、蛋白构象有影响，而且从结果看这种相互作用对OVA的二级结构影响更大。

　　4表面疏水性

　　从图3D可知，在实验设计的配比范围内，OVA-RES以1∶1物质的量比复合时，RES对OVA的表面疏水性影响最大，且RES导致OVA的表面疏水性增加，其最高吸收峰峰高变化为4.65%（P＜0.05）。可能是因为RES作为小分子化合物可以进入OVA内部与之相互作用，从而影响到OVA的疏水性空腔，使得内部的疏水性氨基酸暴露在蛋白质的表面。OVA-RES物质的量比为2∶1对OVA表面疏水性的影响程度与1∶2相当，且都不如物质的量比为1∶1影响大。总之，在实验所设计比例范围中，OVA-RES物质的量比为1∶1是最佳比例，因此后续的实验以1∶1为OVA-RES复合物配比。

　　5圆二色谱

　　由图4可知，OVA二级结构受到RES的干扰，OVA-RES在190、208 nm和222 nm附近的峰强绝对值较OVA都有所增加，即RES使得OVA的α-螺旋含量增加。复合物和单一蛋白的二级结构含量虽然无显著差异（P＞0.05），但是变化主要发生在α-螺旋和β-折叠结构上，而OVA过敏原表位的氨基酸残基组成50%以上是疏水性氨基酸，且主要处于α结构和β结构上面，结合表面疏水性结果分析，RES可能是通过氢键、范德华力与OVA相互作用促使疏水性氨基酸环境改变，从而影响到OVA的二级结构。

　　6潜在致敏性

　　OVA和RES以物质的量比1∶1进行复合，利用进行间接竞争ELISA法测定OVA、OVA-RES的IgG、IgE结合能力，结果以抑制率表示。IC50值越大，样品与IgE的结合能力越弱。从图5可知，RES的加入导致OVA的IC50值显著变小（P＜0.05），即RES与OVA相互作用导致OVA与IgG、IgE结合能力变强，即潜在致敏性显著增强。水溶性极差的RES与OVA相互作用，促使蛋白质的疏水性氨基酸暴露在蛋白质表面，蛋白质结构相对展开，内部的IgG、IgE结合位点更多地暴露在表面，表面可及性提升，使得OVA的潜在致敏性增强。

　　结 论

　　本研究以RES和OVA为研究对象，利用荧光光谱法、圆二色谱法探究OVA-RES复合物相互作用的机理，且从体外血清学角度评价OVA-RES复合物的潜在致敏性。RES通过动态猝灭方式猝灭OVA的内源性荧光，两者最佳复合比为物质的量比1∶1，两者相互作用的主要作用力是氢键、范德华力，属于ΔG＜0的自发过程。另外同步荧光、三维荧光、外源性荧光、圆二色谱结果都表明RES可引起OVA氨基酸残基微环境和构象的变化。OVA-RES相互作用导致蛋白质疏水性增加、结构展开，并且可增强OVA的IgG、IgE结合能力，即RES可能会增强OVA的潜在致敏性，这可能与相互作用导致结构展开后暴露更多的过敏原表位有关。

　　本文《卵白蛋白-白藜芦醇相互作用机理及其对卵白蛋白的影响》来源于《食品科学》2021年42卷4期31-37页，作者：操强，胡巍，高金燕，陈红兵，佟平。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190918-228。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。