《Science Adv.》水凝胶交联释放的一氧化氮

内皮细胞（EC）中一氧化氮（NO）的产生会刺激血管生成，NO是血管扩张剂，可促进EC的生长和迁移，从而促进现有血管的新血管萌芽。间充质干细胞（hMSCs）再生组织已取得重大进展，但为了成功的临床应用，应彻底研究供体细胞特性的在衰老过程中的逐步改变。骨髓源性MSC（BMSC）广泛用于临床，脂肪组织来源的MSC（ADSC）可大量分离。这两种类型的hMSC具有许多共同的生物学特性，治疗效率和安全应用。但是，越来越多的证据表明，BMSC和ADSC具有不同的免疫表型，分化潜能，转录组，蛋白质组和免疫调节活性。NO的调节作用可能会区分BMSC和ADSC的血管生成。韩国Mi-Lan Kang等科学家们在《Science Advanced》上发表了“Hydrogel cross-linking–programmed release of nitric oxide regulates source-dependent angiogenic behaviors of human mesenchymal stem cell”.他们通过微生物转谷氨酰胺酶（mTG）的明胶交联产生氨（NH3），随后通过进生物合成反应长时间释放NO（NO凝胶）。作者比较了NO对EC分化和ADSCs与BMSCs的周细胞促血管生成作用。NO凝胶在BMSCs中诱导了周细胞作用，通过增强血管稳定性，与凝胶基质内部EC的紧密接触定位，可增强动物伤口愈合。

1、NO凝胶制备

在明胶交联过程中，mTG催化谷氨酰胺的γ-羧酰胺基[-（C═O）NH2 ]与赖氨酸的ε-氨基（-NH3）形成异肽键，产生NH3并在明胶中沉积。通过NO循环与其他循环（例如尿素循环）的生物合成偶合，使NH2部分氧化而连续释放NO。通过控制交联度（交联剂重量/总溶液体积％）：2.4％（＃1），4.8％（＃2）和9.6％（＃3）]来改变凝胶刚度。凝胶模量随着mTG浓度从NO2.4％凝胶（＃1：〜1.5 kPa）增加到4.8％（＃2：〜2.3 kPa）并进一步增加到9.6％（＃3：〜3.4 kPa）。在2.4％（＃1）的NO凝胶中培养的ADSCs和BMSC的生长和萌芽优于4.8％（＃2）和9.6％（＃3）的NO凝胶（图1C）。三种测试凝胶之间NO浓度相等情况下改变刚度，向2.4％（＃1）和4.8％（＃2）的NO凝胶中添加氨以达到9.6％（＃3）的水平，只有2.4％（＃1）的凝胶表现出促进血管萌芽的作用（图1D）。结果表明，除了具有促血管生成的NO作用外，凝胶刚度在调节hMSC行为（例如萌芽生长）中也起着关键作用，其中2.4％（＃1：〜1.5 kPa）的NO凝胶是最有利的。

图1. NO凝胶的表征。（A）以不同比例的明胶和mTG制备的NO凝胶的弹性模量。（B）（i）NO凝胶的氨浓度。（ii）5天培养后，NO凝胶中ADSC的细胞内多胺浓度。（C）在经过染色7天培养后，两种hMSC类型在NO凝胶中的生存（活（绿色）/死（红色））。（D）用大鼠主动脉环在NO凝胶中的离体培养从微血管中萌芽，并对萌芽面积进行定量分析。（i）向2.4％（＃1）和4.8％（＃2）的NO凝胶中补充氨以达到等于9.6％（＃3）的水平。（ii）确定从7天到10天的血管萌芽面积的增量倍数(以与NO凝胶 9.6％（＃3）相对应的值设为1的比率表示)。

2、hMSC在NO凝胶中的单培养

培养14天后，作者比较了在2.4％NO凝胶中第3代（P3）和第6代（P6）时ADSCs和BMSCs的促血管生成行为。ADSCs的两个传代均显示出与管形成的细胞-细胞相互作用，但是在BMSCs的两个传代中均未观察到这种形态（图2Ai）。与组织培养聚苯乙烯（TCPS）上的二维培养相比，ADSC的凝胶培养中的促血管生成基因，血小板EC粘附分子1（PECAM1）和胎儿肝激酶1（Flk1）均显着上调（图2A ii）。然而，与P3细胞相比，凝胶中仅BMSC的P6表达CD34，PECAM1，Flk1，且血管内皮钙粘蛋白（VE-cadherin）基因的水平明显高于TCPS（图2Aii）。在两种hMSC类型中，总体基因表达从P3增加到P6。EC标记PECAM1和Flk1在ADSC中的蛋白表达明显高于在BMSC中的蛋白表达（图2Bi）。与在NO凝胶中培养后第14天的BMSC相比，ADSCs还表现出明显更高的低密度脂蛋白（LDL）摄取量（图2Bvi）。同时，在NO凝胶培养中，BMSCs中血管生成素1（ANGPT1）（一种周细胞介导的血管稳定因子）的累积分泌比ADSCs更高（图2Biii）。这些结果表明，与BMSC的周细胞样特征相比，NO凝胶为ADSCs分化为EC样细胞提供了更大的潜力为了确定NO凝胶系统是否在细胞内和其他环境上均产生NO，测量了hMSC的细胞内NO水平和培养基中的外部NO水平。因为NO可以被氧化成亚硝酸盐（NO 2 - ）和硝酸（NO 3 - ），这些阴离子的浓度为总NO浓度。与2D TCPS培养相比，hMSC的3D NO凝胶培养14天表现出明显更高的总NO浓度（图2C）。氨基胍（AG）可抑制一氧化氮合酶（NOS），AG处理显着减少了两种hMSC类型的管形成（图2Di-ii）。培养人脐静脉EC（HUVEC）中的NO凝胶中没有NO产生（图2Diii）。与2D TCPS培养相比，3D NO凝胶培养显示出NO生物合成过程中更高的的相关基因表达水平（图2D-iii）。

图2、体外NO凝胶培养14天时EC样ADSC和周细胞样BMSC在P3和P6的行为。（A）（i）活（绿色）/死（红色）细胞的形态比较。红色箭头表示通过细胞壁形成的管状结构。（ii）NO凝胶培养后，基因CD34，PECAM1，Flk1和VE-钙粘蛋白的表达。（B）（i）NO凝胶培养后，hMSCs中PECAM1和Flk1蛋白的免疫染色和（ii）蛋白质分析。（iii）通过酶联免疫吸附测定（ELISA）在NO凝胶培养后从hMSC分泌血管生成素1（ANGPT1 ）。（iv）在NO凝胶中培养第14天用LDL处理1天，定量测定hMSC对低密度脂蛋白（LDL）的吸收。（C）在NO凝胶培养后第5天和第14天，hMSC的NO浓度。（D）（i）用NO抑制剂氨基胍（AG）处理，在NO凝胶培养后对hMSC的NOS进行免疫染色。（ii）在AG处理（1 mM）后第5天进行NO凝胶培养，通过hMSC对管形成进行定量分析。（iii）NO生物合成相关基因，白介素-6（IL-6），簇蛋白（CLU），前列腺素-I合酶（PTGIS），五环素相关蛋白3（PTX3）和细胞间粘附分子1的表达水平（ICAM1）。

3、在NO凝胶中共培养MSC和EC

在NO凝胶内与HUVEC共培养14天时，NO引导的血管生成机制的差异变得更加明显。将hMSC置于NO凝胶中后，以HUVEC作为单层接种在凝胶表面上（图3A）。将没有hMSC的HUVEC作为对照（即，HUVEC单培养）。第7天时，HUVEC簇在ADSC共培养物中萌芽更多，第14天时，只有BMSC共培养显示出稳定萌芽。ADSCs在凝胶表面上与2D HUVEC网络表现出类似EC的共形成，而BMSC在14天之内在3D内部基质中与HUVECs发生了周细胞样共定位（图3B）。与第14天的ADSC共培养相比，第6天的BMSC共培养诱导PDGF-BB分泌（图3C-i），而HUVEC单培养在整个培养期间保持最高的分泌水平。ANGPT1由周细胞产生，可稳定新形成的血管。在14天的培养过程中，BMSC共培养比其他组分泌更多ANGPT1（图3C-ii）。VEGF是内皮细胞最重要的生长和存活因子之一，VEGF在ADSC共培养物中的分泌更多（图3C-iii）。作者对830个周细胞标记物进行了层次聚类分析，并将其应用于微阵列结果，并提出基因的不同表达模式（图3D）。在单培养中、与HUVEC共培养中、在单培养和共培养条件之间，BMSC和ADSC之间的基因表达模式都存在很大差异。与单一培养中的ADSC相比，BMSC 中细胞色素P450家族1亚家族B成员1（CYP1B1）的表达更高（8.08倍），而在共培养中则不高（0.23倍）。这一趋势在逆转鞘氨醇-1-磷酸受体1（S1PR1）表达，在单培养中BMSC中的表达低于ADSC中的（0.24倍），而在共培养中则显着增加（27.85倍）。qPCR（图3E）和免疫染色（图3F）证实了该结果。

图3、在NO凝胶中将hMSC与HUVEC体外共培养14天。（A）在第1、7和14天与ADSCs或BMSCs共培养的HUVEC RFP的形态。（B）z-stack共聚焦显微镜。（C）促血管生成因子的分泌（i）PDGF-BB，（ii）ANGPT1和（iii）VEGF。（D）从周细胞标记基因的表达层次聚类分析。（i）右侧显示了B与A相比BH与AH的表达增加和（ii）表达降低。通过（E）实时qPCR确认CYP1B1和S1PR1表达。（F）免疫染色。

4、NO凝胶中的离体培养

在与大鼠主动脉环的离体共培养中，CYP1B1的表达模式与共培养结果相似（图4A）。在带有主动脉环的两种共培养条件下，其表达均维持在高水平。与ADSC共培养相比，BMSC共培养中S1PR1的表达更高（图4B）。神经/神经胶质抗原2（NG2）由血管结构的周细胞产生。NG2在两种hMSC类型的单一培养物中均高表达。与ADSC共培养相比，NG2在BMSC-主动脉环共培养中的表达增加更多（图4C）。表达模式与PDGFRβ相似（图4D），PDGFRβ是周细胞增殖，迁移和存活的关键调控因子。

图4. 大鼠主动脉环的离体共培养和hMSC NO凝胶培养。周细胞标志物（A）CYPB1，（B）S1PR1，（C）NG2和（D）PDGFRβ的免疫染色分析通过（i）合并的z-stack共聚焦图像，（ii）正交显像和（iii）3D图像进行分析。

5、体内伤口愈合测定

NO通过胶原蛋白的沉积以及细胞的迁移和增殖可促进伤口愈合。此外，MSC对皮肤伤口愈合和皮肤再生有益。在这个伤口愈合的体内模型中，含有BMSC的NO凝胶使伤口闭合更快（图5A）。图像分析通过Masson三色（MT）染色定量确定伤口愈合模型中NO凝胶的剩余面积（图5B-i和图5B-iii中的黄点区域），从仅使用NO凝胶的组到ADSC + NO凝胶组，再到BMSC + NO凝胶组，剩余的凝胶面积显着减少，表明愈合速度差异（图5C-ii）和凝胶降解（图5C-iii）与细胞周长或EC相关。

图5. hMSCs嵌入NO凝胶中14天的体内伤口愈合研究。（A）测试组中伤口闭合部位的宏观图像。（B）（i）MT染色，定量分析（ii）通过未再生颗粒的长度计算缺陷长度组和（iii）剩余的凝胶区域作为体内凝胶降解的指标。（C）（i）对周细胞标记和hNuclei阳性的细胞数量进行定量分析。（ii）周细胞标记物和hNuclei的免疫染色图像。

6、体内凝胶测定

14天后，含有ADSC的NO凝胶组中观察到了更明显的血管结构（图6A）。通过将荧光注射到小鼠心脏的左心室中，在ADSC和BMSC组中证实了血液灌注，表面功能性血管形成（图6B）。与其他组相比，ADSC组显示出更高的荧光强度。MT染色结果表明，与其他组相比，更多的细胞迁移至ADSC组的凝胶表面（图6C）。此外，与其他组相比，ADSC组的血管密度增加（图6D）。这些结果表明，但在体内凝胶试验中，NO凝胶可促进ADSC的EC增长，从而比BMSC更有效地诱导新血管形成。

图6. 在NO凝胶中使用hMSC进行的体内凝胶塞研究。（A）在裸鼠的背部皮肤下皮下植入栓塞的测试组。（B）通过Z-stack共聚焦显微镜通过心脏左心室注射荧光，可灌注血管形成的3D可视化。（C）MT和（D）Flk1对收获的样品进行染色。

文献参考：DOI：10.1126 / sciadv.aay5413

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