星点设计-效应面法优化pH值响应及线粒体靶向双功能金丝桃苷脂质体的处方及其体外评价

摘 要：目的 优化线粒体靶向金丝桃苷脂质体（DLD/Hyp-Lip）制备的最佳处方，并研究研究其在胎牛血清中的稳定性及体外释放行为，考察其线粒体靶向性。方法 采用薄膜分散法制备DLD/Hyp-Lip，以包封率和载药量为考察指标进行单因素实验，考察磷脂总量与金丝桃苷（hyperoside，Hyp）用量比、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）与DLD用量比等条件对DLD/Hyp-Lip的影响，结合星点设计-效应面法优化DLD/Hyp-Lip处方。使用透射电子显微镜和粒径仪观察测定脂质体粒子外观、平均粒径和Zeta电位，采用血清稳定性实验和体外释药、线粒体靶向性对该载药系统进行评价。结果 DLD/Hyp-Lip最佳处方为磷脂总量和金丝桃苷用量比为12.50∶1，磷脂总量与胆固醇用量比为6.00∶1，DSPE- PEG与DLD用量比为3∶5；测得金丝桃苷包封率为（95.57±0.56）%，载药量为（8.55±0.57）%。所制备的DLD/Hyp-Lip外观良好，平均粒径为（124.9±3.4）nm，Zeta电位为（−6.2±1.9）mV；在胎牛血清中性状稳定，在体外释放介质中24 h累积释放量达到40%。线粒体靶向实验表明DLD/Hyp-Lip可以促进药物聚集在线粒体部位。结论 采用此方法能够精准有效的优化DLD/Hyp-Lip的制备工艺，该方法操作简单方便，可以用于DLD/Hyp-Lip制备与处方的优化，制备的DLD/Hyp-Lip包封率高，粒径小，分布均匀，且具有良好的缓释作用，为DLD/Hyp-Lip的进一步体内研究奠定了基础。载金丝桃苷的DLD/Hyp-Lip具有良好的肝癌细胞线粒体靶向性，是一种潜在高效的肝癌细胞线粒体靶向给药系统。

恶性肿瘤仍然是严重危害人类健康的常见病、多发病。随着环境污染的加剧、生活节奏的加快以及生活方式和饮食结构的改变，恶性肿瘤的发病率与死亡率都有不同程度的增长。2015年我国新发肿瘤病例达429万，占当年全球新发病例2 145万的20%；同年全球肿瘤死亡病例达880万，其中我国肿瘤死亡病例高达281万，死亡率更是高居世界榜首[1-2]。

近几十年来，随着医学科学的发展，恶性肿瘤的临床与基础研究取得了可喜的成就，形成了手术治疗、放射治疗、化学治疗、生物疗法、中医药治疗共5大治疗体系[3]。近年来，应用纳米技术递药系统治疗恶性肿瘤已成为该领域的研究热点。纳米技术包括包合物、微乳剂、纳米囊、纳米球、纳米粒、脂质体、纳米混悬剂[4]，其中，脂质体凭借其具有生物相容性、磷脂无毒可生物降解，既能运载脂溶性药物，又能运载水溶性药物，延长药物在体内的作用时间，防止药物在抵达靶组织前被代谢降解的特点逐渐引起研究人员的关注[5-7]。但普通脂质体在进入体循环时迅速被网状内皮系统（RES）摄取，从而在血液中被清除；靶向效果不理想，不能完全靶向于亚细胞器，严重降低药物疗效；体内作用时间短，迅速被降解排泄出体外[8]。基于普通脂质体的不足，多功能靶向脂质体已成为肿瘤制剂中的研究热点，其中以pH值响应性同时结合线粒体靶向性为特点构建的脂质体递药系统逐渐成为了靶向给药系统的研究主流。

从植物中提取的天然化合物是肿瘤治疗药物的一个宝贵来源。金丝桃苷（hyperoside，Hyp）又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，属于黄酮醇苷类化合物。研究表明金丝桃苷能够明显抑制恶性肿瘤的增殖，金丝桃苷对眼睑麟状癌细胞、胃癌BGC-823细胞、乳腺癌MCF-7细胞、人肺腺癌A549细胞、结肠癌HCT8/VCR细胞、肝癌HepG2细胞、人前列腺癌PC3细胞等均具有治疗作用[9]。金丝桃苷抗肿瘤的作用机制主要是通过调控钙离子相关的线粒体通路，当线粒体内Ca2＋超载可诱导线粒体膜通透性转运孔开放，导致细胞色素C和凋亡诱导因子从线粒体释放到细胞质中[10-11]，最终导致细胞凋亡。同时，金丝桃苷还可通过Ca2＋可通过Caspase途径诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期及对一些其他细胞信息转导通路进行调控。

本实验采用新型pH值响应性材料二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-赖氨酸-2,3-二甲基马来酸酐（1,2- distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-lysine-2, 3-dimethylmaleic anhydride，DSPE-Lys-DMA，DLD），将金丝桃苷制成线粒体靶向脂质体，在pH 7.4条件下，脂质体带负电荷。当脂质体积聚在肿瘤组织中时，微环境中的弱酸性破坏结构中的酰胺键，从而释放带正电的氨基，氨基促使脂质体细胞内化。带正电荷的脂质体引起“质子海绵效应”以触发封装的药物的释放。同时，本实验采用单因素实验结合星点设计-效应面法优化处方，并对优化后DLD/Hyp-Lip的粒子外观、粒径和电位，稳定性及体外释放特征进行了考察，采用线粒体靶向性对该载药系统进行评价，为DLD/Hyp-Lip的进一步体内研究奠定了基础，也为抗肿瘤药物研究及开发提供新的思路。

1仪器与材料

LC-20AT岛津高效液相色谱仪，SPD-20A型二极管阵列检测器，日本岛津公司；OSB-2200型旋转蒸发仪，上海爱郎仪器有限公司；FA-2004型电子分析天平，上海良平仪器仪表有限公司；ZetasizerNano-ZS90激光粒度分析仪，英国马尔文仪器有限公司；CM-120型透射电子显微镜，荷兰飞利浦公司。金丝桃苷对照品，批号111521-201708，中国食品药品检定研究院；大豆卵磷脂（SPC），批号S100，上海吉至生化科技有限公司；胆固醇，批号150800，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（1,2-distearoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine-polyethyleneglycol，DSPE-PEG）、DLD，上海梵圣生物科技有限公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；色谱乙腈，北京迪科马科技有限公司。

2方法与结果

2.1 DLD/Hyp-Lip、SPC/Hyp-Lip和DLD-Lip的制备

2.1.1DLD/Hyp-Lip的制备 采用薄膜分散法，按处方量精密称定大豆卵磷脂、胆固醇、金丝桃苷、DSPE-PEG、DLD，溶于混合溶剂（三氯甲烷-甲醇2∶1）中，超声溶解后在35 ℃下减压旋转蒸发除去有机溶剂，待瓶底形成均匀的薄膜后，加入PBS，超声水化5 min，探头超声5 min，过0.22 μm有机滤膜后，即得DLD/Hyp-Lip。

取新鲜制备的DLD/Hyp-Lip溶液，加入10%的甘露醇作为冻干保护剂，−20℃条件下预冻24 h后于冷冻干燥机中冻干48 h，即得DLD/Hyp-Lip冻干粉末。

2.1.2SPC/Hyp-Lip的制备 按处方量精密称定SPC、胆固醇、金丝桃苷原料药，制备方法同“2.1.1”项方法。

2.1.3DLD-Lip的制备 采用薄膜分散法，按处方量精密称定大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG、DLD，溶于混合溶剂（三氯甲烷-甲醇2∶1）中，超声溶解后在35 ℃下减压旋转蒸发除去有机溶剂，待瓶底形成均匀的薄膜后，加入PBS，超声水化5 min，探头超声5 min，过0.22 μm有机滤膜后，即得DLD-Lip。

2.2 DLD/Hyp-Lip包封率和载药量的测定

采用高速离心法测定。取DLD/Hyp-Lip 0.5 mL，加入2.0 mL甲醇，超声破乳10 min，过0.22 μm有机滤膜后，进行HPLC分析测定金丝桃苷质量浓度（C总）。

色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（22∶78）；检测波长为360 nm；体积流量为1 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

取0.5 mL DLD/Hyp-Lip，加入2.0 mL超纯水，置于超滤离心管中，12000 r/min离心（10 ℃）20 min后，取下层溶液，过0.22 μm有机滤膜后，进行HPLC分析测定金丝桃苷质量浓度（C游）。按照公式计算DLD/Hyp-Lip的包封率和载药量。

包封率＝1－C游/C总

载药量＝W药/W脂

W药代表金丝桃苷的质量，W脂代表大豆卵磷脂、金丝桃苷、胆固醇、DSPE-PEG、DLD和甘露醇的总质量

2.3单因素试验考察

以包封率和载药量为评价指标，以有机溶剂与PBS体积比（油水比）、DSPE-PEG与DLD用量比、磷脂总量与金丝桃苷用量比、磷脂总量与胆固醇用量比进行单因素试验考察。

2.3.1油水比考察 按“2.1”项下DLD/Hyp-Lip的制备方法，设置油水比1∶1、1∶2、1∶5，保持其他条件恒定，考察不同油水比对脂质体包封率和载药量的影响，结果见表1，综合考虑确定油水比1∶1。

2.3.2DSPE-PEG与DLD用量比考察 按“2.1”项下DLD/Hyp-Lip的制备方法，设置DSPE-PEG与DLD用量比为1∶1、1∶2、1∶3，保持其他条件恒定，考察DSPE-PEG与DLD用量比对脂质体包封率和载药量的影响，结果见表2，综合考虑确定DSPE-PEG与DLD用量比为1∶2。

2.3.3磷脂总量与胆固醇用量比考察 按“2.1”项下DLD/Hyp-Lip的制备方法，设置磷脂总量与胆固醇用量比2∶1、5∶1、10∶1，保持其他条件恒定，考察磷脂总量与胆固醇用量比对脂质体包封率和载药量的影响，结果见表3，综合考虑确定磷脂总量与胆固醇用量比为2∶1。

2.3.4磷脂总量与金丝桃苷用量比的考察 按“2.1”项下DLD/Hyp-Lip的制备方法，设置磷脂总量与金丝桃苷用量比5∶1、10∶1、20∶1，保持其他条件恒定，考察磷脂总量与金丝桃苷用量比对脂质体包封率和载药量的影响，结果见表4，综合考虑确定磷脂总量与金丝桃苷用量比为10∶1。

2.4星点设计-效应面法优化DLD/Hyp-Lip处方

2.4.1星点设计-效应面试验设计 在单因素考察试验基础上，选择磷脂总量与金丝桃苷用量比（X1）、磷脂总量与胆固醇用量比（X2）、DSPE-PEG与DLD用量比（X3）为考察因素，每个因素设定5个水平（−1.682、−1、0、+1、+1.682），以包封率（Y1）和载药量（Y2）为考察指标，试验安排及结果见表5。

2.4.2模型拟合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6软件，以Y1、Y1为响应参数对因素X1、X2、X3进行二次多项式回归方程拟合，得拟合方程分别为Y1＝93.87＋0.85 X1－0.42 X2＋9.74 X3＋0.59 X1X2－2.7 X1X3＋1.51 X2X3－10.45 X12－8.81 X22－16.55 X32，R2＝0.848 9，P＜0.000 1；Y2＝8.55＋0.044X1－0.33X2＋0.85 X3＋0.23 X1X2－0.14 X1X3＋0.072 X2X3－1.24 X12－1.41 X22－2.24 X32，R2＝0.818 4， P＜0.000 1。从拟合方程的R2与P值可知，2次多项式拟合较好，可用此模型对DLD/Hyp-Lip进行预测和分析。Y1、Y1回归方程的方差分析见表6。结果发现Y1、Y1模型项均P＜0.000 1，说明回归方程的关系是极显著的。对于Y1、Y1模型方程，X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X2X3、X12、X22、X32都是显著项，是Y1、Y1的显著影响因素，交互影响因素3D效果图与等高线图见图1、2。

2.4.3响应面优化与预测 结合实验要求，公共区域中响应面值较高部分为最佳的区域，并选择最佳 范围，确定最佳范围是11.00≤X1≤14.00，4.00≤X2≤8.00，0.40≤X3≤0.80。采用Design-Expert 8.0.6软件优化考察因素范围。最终确定DLD/Hyp-Lip处方为X1＝12.50，X2＝6.00，X3＝0.60，此时Y1＝ （95.57±0.56）%，Y1＝（8.55±0.57）%。

2.4.4优化后的处方验证 综上所述，确定DLD/ Hyp-Lip最优处方工艺为磷脂总量与金丝桃苷用量比为12.50∶1，卵磷脂与胆固醇的用量比为6.00∶1，DSPE-PEG与DLD用量比为3∶5。按该工艺条件制备3批DLD/Hyp-Lip样品，将检测结果与拟合方程的预测值进行对比，按公式相对偏差＝(预测 值－实测值)/预测值计算相对偏差，以评估模型方程的可靠性。各批样品包封率预测值为94.90%、载药量预测值为8.5%，实测值分别为95.52%、94.84%、96.02%（n＝3）和8.67%、8.52%、8.43%（n＝3），实测平均值分别为95.46%和8.54%，实测值与预测值之间的相对偏差＜5%，说明优选的处方工艺稳定可行。

2.5DLD/Hyp-Lip的外观

取DLD/Hyp-Lip冻干粉末3批，对其颜色进行观察；取DLD/Hyp-Lip，稀释至一定倍数后，滴至专用铜网上，用磷钨酸染色后，自然晾干，于透射电子显微镜（TEM）下观察粒子的形态并拍照，结果见图3。结果表明，制备的DLD/Hyp-Lip冻干粉末为淡黄色粉末，TEM下观察脂质体圆整，呈类球形，外观良好。

2.6 DLD/Hyp-Lip粒径、Zeta电位的测定

制备3批DLD/Hyp-Lip，用粒径仪测定其粒径和Zeta电位，结果见图4。结果表明，DLD/Hyp-Lip的粒径为（124.9±3.4）nm；多分散指数（PDI）为0.164±0.062，表明各脂质体的粒度分布较为均匀；Zeta电位为（−18.2±1.9）mV。

2.7 pH值诱导时的电位变化

考察DLD-Lip在不同pH值缓冲溶液中的Zeta电位变化，取1 mL DLD-Lip加入到15 mL磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4、6.8）和醋酸缓冲溶液（pH 5.5、4.5）中，并于37 ℃下孵育。0、2、4、6、8、12 h时，取1.5 mL样品进行Zeta电位测定。结果见表7，DLD-Lip在pH 7.4下带负电荷；当pH值降至6.8时，DLD-Lip表面电荷至中性，并在2 h后达到稳定水平；当pH值降至5.5及4.5时，DLD- Lip表面电荷翻转至正电荷，电位稳定后高达10～20 mV。

2.8血清稳定性研究

通过测定DLD/Hyp-Lip在胎牛血清中的粒径变化，以评估脂质体在血清中的稳定性。取磷脂质量浓度为5 mg/mL的脂质体与等体积的胎牛血清混合后于37 ℃下进行孵育模拟生理条件。于1、4、8、24 h时，取100 μL样本进行粒径测定，结果见图6。脂质体0 h粒径为在pH 7.4的PBS溶液中测定得到的粒径。结果表明，DLD/Hyp-Lip在0～1 h粒径有明显增加，1～5 h粒径增加缓慢，5～24 h粒径几乎不再增加，性状稳定。

2.9体外释药速率的测定

采用透析法测定DLD/Hyp-Lip在释放介质中的体外释放度。精密量取0.1 mL DLD/Hyp-Lip及游离金丝桃苷溶液（金丝桃苷质量为0.5 mg/mL），置于预先处理好的透析袋（截留相对分子质量为 6 000～8 000）中，并置于50 mL的释放介质中，保持转速为50 r/min，释放介质的温度为（37.0±0.5）℃，释放介质分别为含有0.1%聚山梨酯80的PBS溶液（pH 7.4、6.8）和含有0.1%聚山梨酯80的醋酸缓冲溶液（pH 5.5、4.5）。分别于0.5、1、2、4、8、12、24 h时，取0.5 mL的释放介质溶液，然后加入等体积的新鲜释放介质继续释放行为的测定。测定样品中金丝桃苷的含量，按照公式计算各时间点的累积释放量（Qn），并绘制释放曲线。

Qn＝(VeCi＋V0Cn)/M药

Ve代表释放介质的置换体积，Ci代表第i次置换取样时释放出的药物浓度，V0代表释放介质体积，Cn代表第n次取样时释放介质中的药物浓度，M药代表脂质体中金丝桃苷含量

DLD/Hyp-Lip和游离金丝桃苷溶液在含0.1%聚山梨酯80的PBS缓冲溶液（pH 7.4、6.8）和含0.1%聚山梨酯80的醋酸缓冲溶液（pH 5.5、4.5）的释放介质中的体外释放结果见图7。结果表明，在4种释放介质中，游离金丝桃苷溶液中金丝桃苷在12 h时的Qn达75%左右，而DLD/Hyp-Lip在12 h时的Qn达到27%左右，24 h内的Qn达到40%左右，与游离金丝桃苷溶液的释放曲线相比，DLD/ Hyp-Lip具有良好的缓释效果。

2.10线粒体中金丝桃苷含量测定

将CBRH-7919细胞以每孔1×105个平行接种于6孔板中将培养板置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育24 h，待细胞贴壁后吸去原培养液，加入2 mL PBS溶液，清洗2次，弃去PBS后加入浓度为10 μg/mL的SPC/Hyp-Lip、DLD/Hyp-Lip溶液，并设置不加任何药物的新鲜培养基做对照组，细胞培养箱孵育24 h，孵育结束后，吸去原培养液，用冷的4 ℃ PBS清洗2次，然后采用线粒体剥离试剂盒提取细胞的线粒体。将细胞重新分散在线粒体剥离缓冲溶液中，在均质器中匀浆15下，将获得的悬浮溶液13000 r/min离心10 min，收集上清液后，再次11 000 r/min离心10 min，进行线粒体分离，沉淀物即为所需线粒体，吸走上清后将线粒体重新分散在300μL PBS中。使用流式细胞仪对线粒体中摄取的金丝桃苷含量进行测定。采用流式细胞仪测定经SPC/Hyp-Lip及DLD/Hyp-Lip给药后的线粒体中金丝桃苷的含量，比较各实验组之间的差异现象，流式分析结果。其中对照组中金丝桃苷含量平均值为1，SPC/Hyp-Lip溶液组中金丝桃苷含量平均值为21，DLD/Hyp-Lip溶液组中金丝桃苷含量平均值可达59，表明DLD/Hyp-Lip可进入肿瘤细胞线粒体中，且含量显著高于SPC/Hyp-Lip溶液组。由图8可知，DLD/Hyp-Lip溶液组的荧光强度要显著高于SPC/Hyp-Lip溶液组，该实验结果进一步表明了DLD/Hyp-Lip能够进入肿瘤细胞线粒体中。

2.11 Caspase-3、9的活性测定

将CBRH-7919细胞以每孔1×105个平行接种于6孔板中，将培养板置于37 ℃、5 %CO2细胞培养箱中孵育24 h，待细胞贴壁后吸去原培养液，加入2 mL PBS，清洗2次，弃去PBS后加入浓度为20 μg/mL的SPC/Hyp-Lip、DLD/Hyp-Lip及金丝桃苷溶液，并设置不加任何药物的新鲜培养基做对照组，细胞培养箱孵育12h。根据Caspase-3、9活性检测试剂盒说明，吸取细胞培养液，备用。用500 μL胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入2 mLPBS洗涤细胞，1 000r/min离心5 min，弃去上清液后，加入100 μL裂解液后转移至600 μL离心管中，冰浴裂解15 min。4 ℃下16 000 r/min离心15 min。将上清液转移到冰浴预冷的离心管中。同时取5 μL样品用Bradford法测定蛋白浓度。取适量样品分别加入Caspase-3、9底物，37 ℃避光孵育过夜，酶标仪405nm检测计算Caspase-3、9的活性。结果见图9，Caspase-3结果显示，与对照组细胞相比，经DLD/Hyp-Lip处理后，Caspase-3的活性增加了近1.6倍，Caspase-9结果显示，与对照组细胞相比，经DLD/Hyp-Lip处理后，Caspase-9的活性增加了近2倍，与其他实验组相比，DLD/Hyp-Lip能够显著增加Caspase酶活性，说明DLD/Hyp-Lip能够增加细胞的摄取，同时DLD能够更快地激活线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡。

3讨论

本实验构建了基于电荷翻转的线粒体靶向金丝桃苷脂质体给药系统，并对所制备的DLD-Hyp-Lip进行制剂学、表征、血清稳定性、体外释放及线粒体靶向性进行评价。

首先，基于对肿瘤细胞微环境的特点及线粒体靶向优势，本课题构建了一种新型脂质体。将具有pH值响应性的2,3-二甲基马来酸酐（DMA）引入到二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）中，以赖氨酸（Lys）为连接点，得到DSPE-Lys-DMA（即DLD）。在pH 7.4条件下，由于DMA中的羧基而使脂质体带负电荷。当脂质体积聚在肿瘤组织中时，微环境中的弱酸性破坏二甲基马来酰胺键，从而释放带正电的氨基。脂质体的表面电荷由负电荷翻转为正电荷，继而和肿瘤细胞膜产生静电吸引作用，增加了对肿瘤细胞的摄取。随着胞吞作用进入溶酶体中，引起“质子海绵效应”，导致溶酶体破裂。具有高正电荷的脂质体与线粒体膜（130～150 mV，内部负电荷）的静电相互作用，使其在线粒体中积聚以实现线粒体靶向作用，最后触发封装药物的释放。

DLD-Lip在不同pH值缓冲溶液中的电位变化结果表明，DLD-Lip在pH 7.4下带负电荷；当pH值降至6.8时，DLD-Lip表面电荷至中性，并在1 h后达到稳定水平；当pH值降至5.5及4.5时，DLD- Lip表面电荷翻转至正电荷，此现象可以说明DLD- Lip可以翻转脂质体的表面电荷，DLD-Lip在血液循环过程中（pH 7.4）表面荷载负电荷，可以减少与负电性的血浆蛋白的相互作用，从而减少对非特异性蛋白的吸附[12-14]并增加载体在血液循环中的稳定性。由于肿瘤细胞膜表面通常为负电性，当DLD- Lip通过高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR）在肿瘤部位（pH 6.8）聚集后，DLD-Lip的电荷翻转效应会增加其细胞内的摄取[15-16]。

本实验在构建pH响应及线粒体靶向的双功能DLD/Hyp-Lip时，发现包封率随着磷脂总量与胆固醇比例的增加而减少，加入适当的胆固醇可以改变磷脂膜的通透性和流动性特征，便于脂质体的制备。同时发现随着磷脂药物比的减小，脂质体包封率先增加后降低，开始阶段加大投药量导致包封率增加是由于脂质体对药物的包覆未达饱和；后来由于被包封药物逐渐增多，使脂质双分子层变形，从而造成脂质体体系不稳定，包封率降低。通过单因素试验筛相关影响因素，发现DSPE-PEG与DLD用量比、磷脂总量与金丝桃苷用量比、磷脂总量与胆固醇用量比这3个因素对Lip的包封率、载药量影响大，呈显著相关性。结合星点设计-效应面法对DLD/Hyp-Lip处方进行优化，经处方验证试验结果表明，实测值与预测值趋势基本一致，说明建立的模型预测效果良好，可以描述响应面和影响因素之间的关系[17-19]。所制备的DLD/Hyp-Lip通过外观观察、血清稳定性实验及体外药物释放实验的测定。结果可以看出脂质体圆整，呈类球形，外观良好，在牛血清中具有足够的稳定性，具有良好的缓释效果。最优处方制备的DLD/Hyp-Lip对金丝桃苷具有很强的包载能力和载药能力。

DLD-Lip的血清稳定性结果表明，在50%血清中，DLD-Lip能够在24 h内保护脂质体结构完整。体外释放试验结果表明与游离金丝桃苷溶液的释放曲线相比，DLD/Hyp-Lip具有良好的缓释效果。据此初步推测，金丝桃苷作为亲脂性小分子药物，包裹在功能性脂质体中，故金丝桃苷表现为释药非常缓慢，有助于延长药物的体内循环时间，提高药物的生物利用度。线粒体中金丝桃苷的含量测定结果进一步表明了DLD/Hyp-Lip具有线粒体靶向性，载金丝桃苷的双功能脂质体进入细胞后，大部分聚集在线粒体部位。Caspase-3、9活性测定发现，Caspase-3的活性增加了近1.6倍，Caspase-9的活性增加了近2倍，说明DLD/Hyp-Lip能够增加细胞的摄取，同时DLD能够更快地激活线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡。在后期实验研究中，进一步考察动物抗肿瘤的药效学试验和体内毒性试验等，综合评价DLD/Hyp-Lip的双功能纳米体系设计的有效性、合理性与安全性。

参考文献（略）

来 源： 冯宇飞，常书源，秦国昭，井中旭，王艳宏．星点设计-效应面法优化pH值响应及线粒体靶向双功能金丝桃苷脂质体的处方及其体外评价 [J]. 中草药, 2020, 51(23):5934-5942.

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