Nature | 斑马鱼表观图谱和基因组三维结构

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斑马鱼是生物医学研究中重要的模式脊椎动物。由于它70%的蛋白质编码基因与人类同源而且有着透明快速的体外胚胎发育， 所以科学家们经常用它来研究早期发育和各种疾病， 比如白血病、多种实体瘤以及阿尔茨海默氏病。可是现有的斑马鱼的基因组功能性研究多局限于对整个胚胎的研究，斑马鱼组织特异性的基因组功能元件系统图谱和基因组三维结构仍然亟待揭示。

从进化上说，斑马鱼的祖先与人类祖先在4亿年前“分道扬镳”，其历经的差异进化时间远长于小鼠与人类的一亿年的差异进化时间。对斑马鱼基因组的功能元件以及基因组三维结构的注释，也将为研究从低等脊椎动物到高等脊椎动物基因组功能性序列进化进化提供宝贵的数据。斑马鱼的基因组功能元件与人的功能元件在进化中产生了什么差异？斑马鱼的基因组三维结构与人的基因组结构相比有哪些相似的地方？什么因素可能影响基因组的进化？斑马鱼的第四号染色体被推测为性染色体，但斑马鱼的性别决定基因一直是个未解之谜，主要因为四号染色体有大量的重复序列，所以现有的参考基因组（reference genome）在此染色体处的组装不甚准确。我们可否通过现代测序手段组装一个更为精确的四号染色体？

2020年11月25日，来自美国西北大学的Duane and Susan Burnham讲席教授和癌症组学中心主任岳峰课题组在Nature上发表题为A map of cis-regulatory elements and 3D genome structures in zebrafish（斑马鱼顺式调控元件图谱和基因组三维结构）的研究论文，第一次系统研究并展示了Tubingen 品系斑马鱼11个成年组织和2个胚胎组织的组织特异性转录组、顺式调控元件图谱、异染色质图谱、DNA甲基化图谱和成鱼的基因组三维结构。通过与小鼠和人的功能元件的比较，该研究组发现了进化上保守的和物种特异的序列和调控网络；并且发现进化上的基因组断裂位点富集在拓扑相关结构域（topologically associating domains, TADs）的边界位置，且这种富集与更强的H3K4me3信号和CTCF结合有关。利用最新的10x，Nanopore 三代测序，以及Bionano 光学图谱测序技术，岳峰课题组还重新组装了Tubingen斑马鱼的四号染色体，为研究斑马鱼的性别决定基因和机制提供了重要资源。

在研究中，岳峰研究组用RNA-seq和H3K4me3信号预测了8311个以前未被定义过的转录物，其中3739个为可能的蛋白质编码基因。通过ChIP-seq (H3K27ac和H3K4me3)和ATAC-seq定义了可能的启动子和增强子，其中有40.9%的启动子和62.5%的增强子首次在斑马鱼中被定义。绝大多数增强子（71.3%）显示出组织特异性，并且与对组织特异性发挥重要作用的基因相关。值得一提的是，用GFP报告基因来验证预测的增强子在体内的活性，在被测试的32个组织特异性增强子中，有87.5% （28个）的增强子在斑马鱼胚胎中显示出相应的组织特异信号。为了绘制斑马鱼大脑更为精细的顺式作用元件图谱，该研究组利用最新的单细胞测序技术（sing-cell ATAC-seq）,展示了25种细胞类型在成年斑马鱼大脑中单细胞染色质开放图谱（chromosome accessibility），并揭示了每种类型细胞中起重要作用的转录因子。在对异染色质和DNA甲基化的研究中，该研究组发现H3K9me3和H3K9me2在同一组织中的分布重合很少，并有重复序列元件SINEs的富集。相对于其他组织，精巢的CpG甲基化程度更高，而大脑的CAC三核苷的甲基化水平明显高于其余组织。同时该研究组用三节点网络（three-node networks）的方法比较斑马鱼与人的组织特异性调控网络，发现在同样的组织中，斑马鱼和人具有十分相似的调控模式，说明了用斑马鱼研究人类转录因子调控网络的价值。

为了研究染色质的三维结构，该研究组利用Hi-C技术绘制了成年鱼大脑和骨骼肌的高分辨率基因组三维结构。通过比较，发现了组织特异的A/B compartment以及组织特异的染色质相互作用环（chromatin loops），这些空间结构的差异与相应的组织特异性基因表达相关。除了CTCF的结合，组织特异性的转录因子在组织特异的相互作用（loops）中发挥作用。

这篇文章另外一个有意思的发现是作者们报道基因组断裂位点绝大多数位于TADs的边界位置，很少有位于TADs中间的。为了找出可能对TADs保守性产生影响的因素，该研究组首先把TADs分为两类：中间含有进化断裂位点的TADs和中间不含有进化断裂位点的TADs。结果，他们发现，中间不含断裂位点的TADs内部总体上显示出更强的相互作用，暗示其内部结构更为紧致。这些不含断裂位点的TADs中的基因表达与同源的人的TADs中的基因表达更为相关，暗示了TADs的稳定和基因表达保守性之间的关联。接着，该研究组又把TADs边界分为了两类：不含进化断裂位点的边界和含有进化断裂位点的边界，然后研究不同组蛋白修饰以及转录在不同TADs边界中的分布特点。他们发现，含有断裂位点的TADs边界富集了更强的H3K4me3信号；比起不含CTCF结合位点的TADs边界，那些含有CTCF结合位点和进化断裂位点的TADs边界有更高的转录活性。这些分析暗示了，H3K4me3信号强弱，有无CTCF的结合和转录活性的高低均可能对TADs边界的稳定性和基因组进化产生影响。

图注：TADs内部相互作用的强弱；TADs边界H3K4me3信号的强弱，有无CTCF的结合和转录活性的高低均可能对TADs稳定性和基因组进化产生影响

最后，为了重新组装四号染色体，该研究组利用Nanopore、10X Genomics和Bionano等长片段测序技术，并结合Hi-C数据，成功重新组装了该染色体。用新的四号染色体序列重新处理Hi-C数据，结果显示，之前提示序列结构异常的信号大部分消失。新组装的4号染色体将为研究斑马鱼性别决定和其上其余重要基因提供重要的支持。

综上所述，该研究报道了目前为止对斑马鱼基因组最为详尽的注释，发现了斑马鱼和人类之间保守和差异的基因调控网络和基因组结构。该研究数据的广度和深度为今后在斑马鱼中的基因功能研究和人类疾病研究提供了丰富的数据源和基因组基础。

据悉，美国西北大学的岳峰教授为本文的通讯作者，实验室的研究助理教授杨红波、博士后栾宇和刘婷婷为本文的共同第一作者。合作实验室包括宾夕法尼亚大学州立大学医学院的Keith C. Cheng课题组、圣路易斯华盛顿大学的王艇课题组和宾夕法尼亚儿童医院的王凯课题组。岳峰课题组的Yanli Wang、王晓涛和张博参与了共同研究，王艇课题组的Hyung Joo Lee和王凯课题组的方力对本文做出了重要贡献。

https://www.nature.com/articles/s41586-020-2962-9

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