酱油酿造用耐盐产乙醇风味酵母的选育及其应用

酱油风味的形成是米曲霉、乳酸菌及酵母菌等多菌种相互作用的结果，其中酵母菌在发酵过程中产生的酯类、醇类等物质，对酱油风味的形成具有十分重要的贡献。目前应用于酱油发酵的酵母菌主要有鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）、球拟酵母（Torulopsis spp.）和假丝酵母（Candida spp.），其中鲁氏接合酵母与球拟酵母应用最广。鲁氏接合酵母是酱油酿造中后期风味形成的重要菌株之一，它在酱油发酵中可以提升乙醇、高级醇及芳香杂醇类物质的含量。

酱油挥发性风味物质的研究中，乙醇作为一种常见的香气成分被检出，其特殊香味对酱油风味有重要影响，且能与酸类物质结合，生成各种风味物质及风味物质的前体，对酱油色泽风味的形成以及改善酱油品质发挥着重要的作用。日式酱油发酵研究发现，提高乙醇含量有利于提升酱油品质。目前对于酱油中挥发性香气成分乙醇的研究主要集中在检测含量及菌种添加引起的风味成分变化，而改良耐盐产乙醇菌种以获得较好的乙醇产量并进行应用研究报道较少。

长沙理工大学化学与食品工程学院的吕变梅、蒋雪薇*和彭东等人利用紫外诱变鲁氏接合酵母L6选育得到1 株优良的耐盐产乙醇酵母L6-1，研究其在高盐稀态发酵中的应用，通过跟踪分析发酵酱醪中乙醇积累量与挥发性风味物质的变化，确定添加产乙醇酵母对酿造酱油品质的提升作用，以期为耐盐产乙醇风味酵母在酱油酿造中的应用提供理论支持。

1 出发菌株的紫外诱变及乙醇高产菌株的筛选

前期从高盐稀态发酵酱醪中筛选出1 株耐盐鲁氏接合酵母L6，其在含10% NaCl豆芽汁培养基中的乙醇积累量（体积分数）为1.75%，有一定的产乙醇能力，适合作为选育耐盐产乙醇酵母的出发菌株。

紫外诱变是物理诱变中最为简便安全的诱变剂，在选育中常作为诱变因子。采用不同的照射时间处理制备好的菌悬液，绘制致死率曲线，结果见图1。研究发现，正突变往往出现在致死率较低的情况下，选择致死率70%～80%的诱变条件处理菌株，除能获得较高的正突变率外，还比较易于筛选，从图1可以看出，致死率为70%～80%时，诱变处理时间为60～90 s，选择诱变时间90 s，处理出发菌株L6，诱变后的菌悬涂布于TTC双层平板，筛选获得54 株生长良好、显色明显的突变菌株。

TTC显色筛选平板如图2a（红色圈标注出的为显色深的菌落），对比54 个显色明显的菌株，选出显色较深的15 株，豆芽汁发酵测定乙醇积累量，结果见图2b。可以看出，突变株1、4、7、8、12乙醇积累量均高于出发菌株L6，将其分别命名为L6-1、L6-4、L6-7、L6-8和L6-12，其中L6-1的乙醇积累量最高，为2.71%，较出发菌株提高54.86%，经5 次传代及保藏，其在10%NaCl的豆芽汁培养基发酵中乙醇积累量平均为2.48%，具有良好的遗传稳定性，可以应用于酱油发酵中。

2 突变株L6-1与出发菌株L6性能比较

在高盐条件下，菌株的生长性能往往会发生一些变化，如迟缓期延长、对数期生长速率降低等。为研究L6-1和L6的生长性能，分别测定其在10%NaCl豆芽汁培养基中的生长曲线，结果见图3a。10%NaCl质量分数下，L6-1和L6同时进入和结束对数期，生长周期一致，但是L6-1菌体浓度稍高于L6。由图3b可知，当NaCl质量分数由5%升高到16%时，L6-1和L6活菌数均下降104 CFU/mL，NaCl质量分数为5%～14%的培养条件下，L6-1活菌数高于L6，而NaCl质量分数为16%的培养条件下，L6活菌数则超过L6-1，但相差不大，突变株L6-1具有较好的耐盐能力，适合应用到酱油发酵中。接种L6-1和L6到不同NaCl质量分数的豆芽汁培养基中，发酵72 h测定乙醇积累量，结果见图3c。随着NaCl质量分数升高，乙醇积累量呈下降趋势，与活菌数变化趋势相符，说明在液体培养基中活菌数直接影响了乙醇的积累，5%～14%的NaCl质量分数下L6-1相比L6产乙醇能力明显增强，有应用于酱油发酵的潜力。

3 L6-1在高盐稀态发酵酱油酿造中的应用

3.1 添加L6-1对高盐稀态发酵酱油乙醇含量及理化指标的影响

鲁氏接合酵母为醇香型酵母，可在pH 5.0～6.0的环境中生长，主要作用于酱油发酵前期，这个阶段主要是原料降解、乳酸菌产乳酸、鲁氏接合酵母进行乙醇发酵，过高或过低添加浓度都不利于乙醇的产生及酱油风味的形成。酱醪发酵开始时pH值为6.5～7.0，发酵到25 d，pH值下降为5.5～6.0，有利于鲁氏接合酵母的生长及代谢，因此发酵25 d作为添加时间。前期预备实验发现，采用菌悬浓度107个细胞/mL、接种量5%能获得较好的发酵效果，采用发酵至第25天的酱醪以上述菌悬浓度及接种量接种L6-1及L6，研究发酵酱醪中随时间而变化的乙醇积累量及各项理化指标。

如图4所示，酱醪发酵25 d添加L6-1及L6，发酵进行到45 d，乙醇积累量分别为1.00%、1.26%，分别比对照组提高78.57%、125%。发酵进行到90 d，L6-1和L6的乙醇积累量分别降到0.58%、0.71%，分别高于对照组48.72%、82.05%。L6和L6-1对酱醪中的乙醇含量均有明显提升作用，L6在高盐稀态酱醪（16% NaCl）中发酵积累乙醇的能力比其突变株L6-1强，这与两株菌在16% NaCl的豆芽汁培养基中表现一致，可见，在高盐环境中，突变株L6-1的生长能力弱于出发菌株L6，从而厌氧代谢产物乙醇的积累量略少；另外，L6-1乙醇积累量小于L6也可能是其生成的部分乙醇被进一步用于合成乙酯类物质，需要进一步研究乙酯类挥发性风味物质。

在发酵25 d的酱醪中接种L6-1、L6，对酱醪中还原糖、总酸和氨态氮含量进行分析。由图5a可知，发酵0～15 d，由于淀粉酶分解碳水化合物，生成低聚糖及葡萄糖等，还原糖呈上升趋势，之后还原糖作为主要碳源被代谢生成乙醇、高级醇与有机酸等物质，其含量开始下降，添加L6-1的酱醪还原糖含量比添加L6下降速率更快；由图5b可知，发酵0～15 d，总酸含量迅速上升，随后增速变缓，发酵60 d，总酸达到最高后开始下降，这一阶段是有机酸类物质与乙醇等醇类物质成酯的时期，酱香在这一阶段开始形成，75 d后由于芽孢杆菌等细菌的作用，总酸又出现了小幅升高，整个发酵过程中总酸质量浓度均未超过25 g/L，符合酿造酱油标准；由图5c可知，发酵0～30 d是米曲霉蛋白酶的主要作用时期，蛋白酶水解蛋白质使氨态氮含量上升，45～75 d由于美拉德反应及微生物作用，游离氨基酸被消耗，氨态氮含量下降，75 d以后，由于细菌的作用，氨态氮含量略有升高，从发酵30 d开始，酱油氨态氮含量开始保持在7 g/L以上，达到一级酿造酱油的标准。总体而言，添加L6-1及L6发酵均有利于还原糖降解，在积累乙醇的同时对酿造酱油重要指标总酸及氨态氮的影响较小。

3.2 添加L6-1对高盐稀态发酵酱油挥发性风味物质的影响

发酵结束时，对照组和添加L6-1与L6发酵组的物质种类数分别为37、47、27 种。如图6所示，添加L6-1的发酵酱油中酯类物质、醇类物质（不含乙醇）、醛类物质、酚类物质、酮类物质、酸类物质分别为17、14、5、4、4、1 种，分别比L6添加组多2、10、4、1、3、0 种。内标法定量分析计算各物质的含量，结果显示，可以看出L6-1、L6、对照组的发酵酱油中醇类含量分别为1 507.87、1 743.72、1 177.63 ng/g，L6-1添加组与L6添加组分别较对照组提高28.04%、48.07%；虽然添加L6-1发酵酱油醇类物质总含量比添加L6酱油低，但添加L6-1的酱油中醇类物质种类更加丰富；酯类物质种类分别为17、15、17 种，含量分别为828.72、583.72、518.56ng/g，L6-1添加组与L6添加组在酯类物质种类差别不大的情况下，其含量分别较对照组提高59.81%、12.57%，其中L6-1添加组乙酯类物质含量最高，为605.64 ng/g，比添加L6及对照组的发酵酱油分别提高6.79%及20.61%。结合其乙醇积累量的变化可知，L6-1积累的乙醇部分被用来合成乙酯类挥发性风味物质，增加了酱油香气的丰富度，因此添加L6-1有利于酱油香气成分的多样性。

结果显示，醇类物质中，具有玫瑰花香的苯乙醇在3 种发酵酱油中都有检测到，添加L6-1发酵酱油中含量最高为1 217.78 ng/g，分别比对照组与添加L6的发酵酱油高出52.57%、9.21%，有肉汤香的3-甲硫基丙醇在对照组与添加L6-1的酱油中都有检测到，具有蘑菇香的3-辛醇、常用作食用香料的二异丁基甲醇只在添加L6-1的酱油中检测到，虽然这3 种物质含量低，但其香气阈值低，对酱油香气贡献大；酯类物质中，具有玫瑰香气的乙酸苯乙酯只在添加L6-1的发酵组中检测出，另外添加L6-1的酱油中一些重要的乙酯类香气物质苯甲酸乙酯（水果气味）、琥珀酸二乙酯（食品加香剂）、辛酸乙酯（水果香）、乙酸苯乙酯（烟草、玫瑰香）、癸酸乙酯（葡萄香）、月癸酸乙酯（树叶香）、十四酸乙酯（鸢尾油香）、棕榈酸乙酯（蜡香）的含量均不同程度高于其他实验组，它们可缓冲酱油的咸味并通过抑制胺类和部分脂肪酸类物质的刺激感及苦味赋予酱油良好的风味；醛类物质中，苯乙醛在3 种发酵酱油中都有检测出，L6对苯乙醛有提升作用，但具有杏仁味的糠醛、苯甲醛和具有可可香味与水果香味的2-苯基巴豆醛、异戊醛只在添加L6-1的酱油中检测到；酚类物质中，L6对异丁香酚、4-乙基愈创木酚均有提升作用，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚与麦芽酚只在添加L6-1的酱油中检测出，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚具有丁香味，麦芽酚有焦奶油硬糖的味道，起到增香、固香、增甜的作用，对酱油香气影响较大。挥发性风味物质的定量分析结果说明添加L6-1能够促进酱油风味物质的形成，提高酱油风味物质的丰富度。

对发酵酱油的挥发性风味物质进一步进行主成分分析，从醇类、酯类、醛类、酚类、酮类、酸类、其他物质七大类物质中提取出2 个主成分，各主成分的贡献率及总贡献率结果显示，所提取的2 个主成分总贡献率达到100.00%，能充分解释各个原始成分。各主成分载荷图如图7所示，在PC1轴上，醇类、醛类、酮类、酸类的相关性系数较大，因此可用PC1解释这4 类物质，其中醇类、醛类及酮类物质呈正相关，而酸类物质呈负相关；PC2轴显示，酯类、酚类、其他物质的相关性系数较大，因此可用PC2解释这3 类物质。

计算各变量的主成分得分系数并计算各主成分得分，结果显示，总得分对照组最低，则L6-1与L6对酱油的风味呈正向贡献，且L6-1得分最高，因此，突变株L6-1有明显提升酱油风味的作用。L6在PC1上得分较高，PC1与醇类、醛类、酮类的相关性系数较大，说明L6对此三类物质贡献较大；L6-1在PC2上得分较高，PC2与酯类、酚类、其他的相关性系数较大，同时PC1上也有较好得分，由于PC1得分的权重系数为0.737，L6-1的总得分与PC1和PC2都有较大相关性，说明L6-1除醇类、醛类、酮类物质贡献较大外，酯类、酚类、其他类物质的贡献也较大。综合乙醇积累量、挥发性风味物质种类、含量及贡献度，可以发现，突变株L6-1接入酱醪后，除提高乙醇为主的醇类化合物种类和含量之外，还对酱油重要的香气成分酯类，特别是乙酯类物质的形成起到了重要的促进作用，有效地丰富了酿造酱油的风味。

结 论

酱油酿造由传统的晒露法及低盐固态发酵发展为现代高盐稀态发酵，其封闭的发酵设备大幅减少了污染菌的质量安全风险，同时也影响了酿造酱油的风味。以鲁氏接合酵母L6为出发菌株，经紫外诱变选育了1 株在10%NaCl豆芽汁培养基中能很好积累乙醇的突变株L6-1，16%NaCl高盐稀态发酵酱醪中对比研究L6-1和L6，发现酱醪发酵45 d时两株菌乙醇含量均达到了最高，分别比对照组提高了78.57%和125%，随着发酵的进行，其乙醇积累量有所下降；挥发性风味物质定量分析发现，添加L6-1的发酵酱油除乙醇外的醇类物质以及酯类物质（特别是乙酯类物质）的丰富度均好于L6，其中乙酯类风味物质含量最高为605.64 ng/g，比添加L6及对照组的发酵酱油分别提高了6.79%及20.61%；主成分分析并评分发现，添加突变株L6-1的发酵酱油得分最高，进一步说明了L6-1除提高酱油乙醇含量外，对酱油风味物质的丰富度及风味具有良好的促进作用。选育耐盐产乙醇酵母，能促进酱醪发酵中乙醇及乙醇为底物的乙酯及其他物质的积累，在提高酱油醇香风味的同时有效提升了酱油风味的丰富度，这为今后酱油酿造风味菌的选育提供了一条围绕核心代谢产物选育的思路，将更有效地提升酿造酱油的品质。

本文《酱油酿造用耐盐产乙醇风味酵母的选育及其应用》来源于《食品科学》2020年41卷20期119-126页，作者：吕变梅，蒋雪薇，彭东，徐晓刚，丁源，罗晓明，周尚庭。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190824-251。

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修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅

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