Genome Biology | 陈其军/高彩霞合作利用引导编辑技术对玉米基因组进行精准编辑

来源 | Genome Biology

编辑 | 王一

近日，中国农业大学生物学院陈其军教授、中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员和河南大学生科院周云教授合作在Genome Biology在线发表了题为“Prime editing efficiently generates W542L and S621I double mutations in two ALS genes in maize”的论文。该研究首次报道了利用引导编辑技术 （prime editing） 对玉米基因组进行精准编辑的研究。

引导编辑技术是一种全新的基于CRISPR/Cas系统的精确基因组编辑技术 【1】 ，但目前在植物（水稻）中的编辑效率普遍较低 【2-8】 。由于pegRNA的引物结合位点 (PBS) 和匹配靶点的间隔子 (spacer) 易杂交形成双链结构，进而削弱pegRNA活性，研究人员推测pegRNA的表达水平是影响引导编辑效率的关键因素之一。为此，该研究采用了两种策略提高pegRNA表达：增加pegRNA表达框的数量及使用两种类型的启动子（常规型和复合型）驱动pegRNA的表达（图1） 。

与之前水稻中的研究结果相比，该研究在玉米上获得了更高的编辑效率（最高约达72%~75%），同时，该研究首次利用引导编辑工具在两个乙酰乳酸合酶基因ZmALS1和ZmALS2中实现了纯合突变，且获得了这两个基因的W542L和S621I双位点突变体（图1）。该研究结果为开发非转基因抗多种除草剂的玉米品系提供了一种可行且有效的方法，也为进一步优化植物引导编辑器 (PE) 提供了方向。值得注意的是，在优化PE过程中，研究人员还意外发现Csy4蛋白对玉米转化的强毒性，提示在植物中应谨慎使用Csy4系统加工sgRNA或pegRNA（图1）。

图1

此外，除了观察到来源于pegRNA支架的副产物，研究人员还观察到一类新型副产物，命名为双链均衡性DNA修复衍生的副产物。这类副产物产生于编辑两个及两个以上碱基的情形 （图2） 。为了克服pegRNA支架衍生的副产物，研究人员提出了设计pegRNA的终止子规则，即将基因组DNA上的几个核苷酸 (如C, GC, TGC, GTGC或更长) 作为设计RT模板的终止信号。

图2

为了进一步分析不同策略对提高编辑效率的贡献，研究人员在水稻原生质体中比较了常规的U3启动子和复合型启动子(CaMV35S-CmYLCV-U6)驱动pegRNA表达时的编辑效率。结果显示，复合型启动子在四个靶点中的三个中编辑效率显著高于常规启动子（图3） 。提高pegRNA表达框数量的策略对提高编辑效率似乎没有贡献，但这可能跟相应的载体过大而影响原生质体转化有关。

图3

总之，该研究结果令人鼓舞，为进一步优化植物引导编辑器奠定了基础。研究结果也为培育非转基因抗除草剂玉米提供了高效方法。

中国农业大学生物学院博士生姜媛媛、柴一萍和作物功能基因组与分子育种研究中心逯敏慧为论文共同第一作者，中国农业大学生物学院陈其军教授和中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员为论文共同通讯作者。该研究受到国家重大转基因专项、国家作物育种重大专项及国家自然科学基金等项目的资助。

参考文献

1. Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR, Sousa AA, Koblan LW, Levy JM, Chen PJ, Wilson C, Newby GA, Raguram A, Liu DR: Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 2019, 576:149-157.

2. Xu R, Li J, Liu X, Shan T, Qin R, Wei P: Development of a plant prime editing system for precise editing in the rice genome. Plant Communications 2020:100043.

3. Hua K, Jiang Y, Tao X, Zhu JK: Precision genome engineering in rice using prime editing system. Plant Biotechnol J 2020.

4. Butt H, Rao GS, Sedeek K, Aman R, Kamel R, Mahfouz M: Engineering herbicide resistance via prime editing in rice. Plant Biotechnol J 2020.

5. Lin Q, Zong Y, Xue C, Wang S, Jin S, Zhu Z, Wang Y, Anzalone AV, Raguram A, Doman JL, et al: Prime genome editing in rice and wheat. Nature Biotechnology 2020.

6. Xu W, Zhang C, Yang Y, Zhao S, Kang G, He X, Song J, Yang J: Versatile Nucleotides Substitution in Plant Using an Improved Prime Editing System. Molecular Plant 2020.

7. Tang X, Sretenovic S, Ren Q, Jia X, Li M, Fan T, Yin D, Xiang S, Guo Y, Liu L, et al: Plant Prime Editors Enable Precise Gene Editing in Rice Cells. Molecular Plant 2020.

8. Li H, Li J, Chen J, Yan L, Xia L: Precise Modifications of Both Exogenous and Endogenous Genes in Rice by Prime Editing. Molecular Plant 2020.

论文链接：

https://doi.org/10.1186/s13059-020-02170-5