鲟鱼硫酸软骨素对结直肠癌患病小鼠肠道菌群的影响

近年来，越来越多的证据表明，肠道微生物的关键生理作用与机体之间有着密切关系，特别是在宿主健康和疾病中发挥着重要作用。肠道菌群可寄居于不同部位，通过特定菌群结构、活动、代谢产物等共同影响机体的代谢，维持内环境稳态。但是肠道菌群与宿主之间存在密切的互利共生关系，菌群的稳定与宿主年龄、遗传背景、饮食、生活环境等相关，反过来，宿主能影响肠道菌群的结构和功能，而肠道菌群也可通过其特有的功能属性，影响宿主的生长代谢。

结直肠是人体中重要的消化器官，具有消化、营养物质代谢以及贮存食物残渣的作用。但是，由于食物残渣以及代谢产生的一些酸类、酚类等致癌物，使得肠屏障的完整性、免疫系统等受到了侵袭和破坏，增加了结直肠癌的患病风险。结直肠癌是常见的一类以体质量减轻、严重腹泻以及腹痛为典型性特征的慢性和复发性消化道疾病，一般发生在回肠、结肠和直肠处。

目前结直肠癌的详细致病机制尚不清楚，肠道微生物、肠上皮屏障以及肠免疫系统构成的稳态失调可能是影响结直肠癌发生的关键因素。前期实验发现，鲟鱼硫酸软骨素具有抑制结直肠癌肿瘤细胞增殖的作用。因此，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心、中国农业大学食品科学与营养工程学院的武瑞赟、李平兰*和天津农学院食品科学与生物工程学院的马俪珍以结直肠癌小鼠为模型，通过对小鼠肠道内容物的细菌菌群多样性进行分析，探究鲟鱼硫酸软骨素对结直肠癌患病小鼠肠道菌群的影响，研究结果为开发以鲟鱼软骨素为基础的膳食营养补充剂以预防和降低结直肠癌发生风险提供实验依据。

1 鲟鱼硫酸软骨素对结直肠癌荷瘤小鼠中肿瘤组织体积与质量的影响

由图1A可知，与模型组相比，低、中、高剂量组实验小鼠的结直肠肿瘤组织体积的增长速率随口服剂量的增加而下降，呈现剂量依赖性，与模型组的体积相比差异显著（P＜0.05）。同时，肿瘤组织质量结果显示（图1B），与模型组比较，随灌胃鲟鱼硫酸软骨素剂量的增加，肿瘤质量显著降低（P＜0.05），表明对于已经形成结直肠癌的小鼠，口服鲟鱼硫酸软骨素可以减缓肿瘤的生长发展，起到治疗的作用。

2 物种相对丰度结果分析

2.1稀释曲线分析

稀释曲线（图2）结果表明，当测序量增多时，样本中物种多样性的增长幅度较低，说明测序量对样本中物种多样性的贡献率较小，当前所选的样本测序量足够多，可以较好地反映样品中的微生物物种信息。

2.2 相对丰度分布曲线分析

Rank-Abundance曲线可以同时用于反映测序样品中所含物种的丰富程度和均匀程度，其中曲线越长，说明物种组成越丰富，曲线越平滑，则表明物种组成的均匀程度越高。丰度分布曲线（图3）中的每条曲线分别对应一个测序样本，横坐标表示OTU相对丰度按等级降序排列，纵坐标表示该OTU中序列数的相对丰度，结果显示，测序样本的物种序列数主要分布在100～700，且组成分布均匀。

2.3 多样性分析

本实验以Chao1指数、ACE值、Shannon指数和Goods’s coverage指数来反映各组样品的物种相对丰度和群落多样性，数值与物种的丰度呈正相关。其中，Goods’s coverage指数可以反映测序深度，数值越高，样本中没有被检出的概率越低。结果显示，各组小鼠的测序深度均为0.98以上、渐近1，且无显著性差异（P＞0.05），表明各组样本的序列基本均被检出。

结果表明，模型组样本的Chao1指数、ACE值均低于正常对照组，说明肠炎疾病可以引起小鼠肠道菌群中物种数量的改变及降低物种数量。同时，模型组的Shannon指数显著高于正常对照组（P＜0.05），说明患结直肠癌可以使小鼠肠道菌群的多样性发生改变并降低。灌胃不同剂量的鲟鱼硫酸软骨素，可以使患病模型小鼠肠道微生物的Shannon指数降低，且逐渐趋于正常组，其中高剂量组的Shannon指数低于阳性对照组。由此可见，灌胃鲟鱼硫酸软骨素能够一定程度上增加结直肠癌患病模型小鼠肠道内的菌群多样性，起到调节肠道微生物菌群的作用。

3 肠道微生物菌落组成结果分析

3.1 基于门水平的微生物菌落结构分析

由图4可知，各组小鼠肠道菌群检测中，样品共注释到14 个细菌门类，分别为产古菌门（Euryarchaeota）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、蓝藻细菌门（Cyanobacteria）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）、厚壁菌门（Firmicutes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、变形菌门（Proteobacteria）、糖化菌门（Saccharibacteria）、螺旋菌门（Spirochaetae）、互养菌门（Synergistetes）、柔膜菌门（Tenericutes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）。其中，拟杆菌门和厚壁菌门为主要的优势菌门。

结果表明，模型组中的梭杆菌门相对丰度（0.008 5%）显著高于正常对照组（0.001 3%）（P＜0.05），经灌胃鲟鱼硫酸软骨素处理后，小鼠肠道中的梭杆菌门相对丰度降低并且趋于正常对照组，其中高剂量组中的梭杆菌门相对丰度约为0.001 4%，表明鲟鱼硫酸软骨素可以改变结直肠癌患病小鼠肠道中的梭杆菌门相对丰度，进而起到对结直肠的调节作用（图5A）。结果发现，灌胃鲟鱼硫酸软骨素后，小鼠中的糖化菌门相对丰度显著增高（P＜0.05），明显高于正常对照组（0.15%）、模型组（0.47%）、阳性处理组（0.33%），且随着灌胃剂量的增加，肠道中糖化菌门的相对丰度增加，其中低剂量组为1.65%，中剂量组为1.85%，高剂量组可达2.10%，说明鲟鱼硫酸软骨素灌胃后能够增加糖化菌门含量，促进多糖的吸收，改变肠道菌群的结构（图5B）。

3.2 基于科水平的微生物菌落结构分析

为了进一步探究鲟鱼硫酸软骨素对结直肠癌小鼠肠道菌群的影响，本实验在门水平基础上，进一步分析了科水平上的变化。结果显示，正常对照组小鼠和灌胃鲟鱼硫酸软骨素高剂量组小鼠中肠道的优势菌均为类杆菌科（Bacteroidaceae）、拟杆菌目S27科（Bacteroidales S24-7 group）和瘤胃菌科（Ruminococcaceae），与正常对照组相比，模型组中的Ruminococcaceae相对丰度由15%降至12%，同时Bacteroidales S24-7 group相对丰度由30%降至18%，且患病模型组小鼠肠道内科水平的优势菌发生了改变，变为Bacteroidales S24-7 group 18%、Lachnospiraceae 18%以及Ruminococcaceae 12%。

近年来，拟杆菌属对癌症的调节作用受到了研究者的关注和证明。实验结果也显示出，灌胃鲟鱼硫酸软骨素后，随灌胃剂量的增加，小鼠中Bacteroidales S24-7 group相对丰度总体呈增加趋势，其中低剂量组仅为31%，高剂量组则可达40%，说明鲟鱼硫酸软骨素可以提高Bacteroidales S24-7 group的相对丰度；与模型组（18%）相比，说明鲟鱼硫酸软骨素可能通过提高拟杆菌属的相对丰度，抑制结直肠癌的发展。灌胃鲟鱼硫酸软骨素后，小鼠肠道菌群中的科水平微生物含量逐渐趋于正常组小鼠，结合在灌胃鲟鱼硫酸软骨素素治疗的过程，以及前期细胞实验的结果，说明鲟鱼硫酸软骨素可以通过调节肠道菌群的平衡，改善肠道炎症的病变。

3.3 基于属水平的微生物菌落结构分析

选取相对丰度在前15%的菌进行属水平的菌落组成分析，结果如图6所示。正常组肠道内相对丰度在2%以上的属水平菌分别为拟杆菌属（16.47%）、Bacteroidales S24-7 group（24.56%）、阿利斯泰伯属（8.48%）、嗜胃气杆菌属（2.21%）、Lachnospiraceae NK4A136 group（3.39%）、Ruminococcaceae UCG-014（9.54%）、Akkermansia（8.48%），与结直肠癌患病小鼠模型组对比发现，Ruminiclostridium 5在患病小鼠的肠道内相对丰度明显升高，由正常组的0.92%升高到2.05%。鲟鱼硫酸软骨素可通过抑制促炎菌的生长改变肠道中菌群的数量，促进抗炎代谢产物的产生，进而增加抗炎能力，抑制癌细胞的增殖，最终起到缓解癌症的作用。

4 组间相似性结果分析

为了更好地比较各组之间的微生物群落结构的多样性和各组肠道微生物组成间的相似性，本实验采用样品聚类的方法进行PCoA（图7）。PCoA中样本点之间的距离越靠近，表明对应的样品间的肠道微生物组成越相似。各组小鼠肠道菌群PCoA二维图中可以看出，两种主坐标分别贡献了11.84%和9.66%的差异。

但是，与正常组相比，阳性对照组各样本间的分散程度较高，说明5-氟尿嘧啶可以能会造成肠道菌群的紊乱，与上文中门水平的注释结果一致。正常对照组、模型组、阳性处理组和灌胃低、中、高剂量的鲟鱼硫酸软骨素各组的菌相组成存在差异。其中，灌胃鲟鱼硫酸软骨素的各组样本之间比较分散，可能是由于样本本身的个体存在差异，且低剂量组和中剂量组与模型组也存在着部分的相似性，而高剂量组则与模型组差异较大，结合之前鲟鱼硫酸软骨素灌胃处理后，小鼠肠道菌群在门、科以及属水平的变化，可以说明鲟鱼硫酸软骨素可以引起小鼠肠道菌群组成的改变。

结 论

本实验利用皮下注射结直肠癌细胞的方法，构建了结直肠癌患病小鼠模型，探究了灌胃鲟鱼硫酸软骨素对结直肠癌小鼠肠道菌群组成的影响。结果显示，鲟鱼硫酸软骨素可以改变小鼠肠道微生物的数量和多样性，结直肠癌患病小鼠中Bacteroidales S24-7 group、毛螺菌科以及瘤胃菌科相对丰度明显优于其他组，为主要的优势菌科，具有增加结直肠癌的患病风险。同时，灌胃鲟鱼硫酸软骨素后，小鼠肠道中的优势菌属发生改变，且部分菌属相对丰度改变，Lachnospiraceae NK4A136 group和Oscillibacter相对丰度明显降低，逐渐趋于正常对照组小鼠，说明鲟鱼硫酸软骨素可通过抑制促炎菌的生长改变肠道中菌群的数量，进而增加抗炎能力，抑制癌细胞的增殖，最终起到缓解癌症的作用。

本文《鲟鱼硫酸软骨素对结直肠癌患病小鼠肠道菌群的影响》来源于《食品科学》2020年41卷15期216-223页，作者：武瑞赟，马俪珍，李平兰。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200209-065。

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