皮肤再生：明胶/胶原/聚己内酯支架

近30年来，通过在皮肤替代物中设计和纳入特定的治疗因素，可以促进伤口愈合以及降低大伤口的发病率和死亡率。胶原基材料是临床上最著名的生物复合材料，基于胶原的伤口敷料已应用于烧伤和溃疡患者的治疗。组织工程皮肤设计中真皮成分主要由胶原组成。然而，纯胶原蛋白产品是脆弱的，在临床应用过程中难以处理。PCL作为可生物降解的聚合物与胶原结合，可以提高机械强度，显示出更好的抗外力作用于伤口处理。但是，目前对于患者而言，基于胶原的伤口敷料是昂贵的，寻找一种可以代替胶原的生物材料非常重要。

因此，Niann-Tzyy Dai和Lin-Gwei Wei团队制备出一种开发了一种基于明胶(‘G’)、胶原(‘C’)和聚（ε-己内酯）(PCL；‘P’)的组织工程皮肤替代物，是一种低成本、高效、机械性强、可生物降解的生物复合材料，并通过体外试验评价其结构、热特性和生物相容性以及在裸鼠全厚度皮肤缺损模型中证实了该生物复合材料促进大尺寸伤口愈合的潜力。该论文发表在PeerJ杂志上，题为“A gelatin /collagen / polycaprolactone scaffold for skin regeneration”，来自台湾的三军总医院整形外科的Niann-Tzyy Dai团队。

首先，他们制备了四种不同比例胶原和PCL的G/C/P生物复合材料。为了测定生物复合材料中明胶和胶原的释放，采用双酸(BCA)法估算了G/C/P生物复合材料在37℃下磷酸盐缓冲液(PBS)中作用12天后蛋白质的释放量。对于胶原含量较低的G/C/P，与GCLPH组相比，GCLPL生物复合材料具有较高的累积蛋白释放。这两种生物复合材料的蛋白质在12小时内迅速释放，但随后减慢。两种生物复合材料在24h的累积释放量(w/w)分别为100%和76%。对于胶原含量较高的G/C/P，相对于GCHPL生物复合材料，GCHPH生物复合材料的蛋白质累积释放较高。24h后的平均累积释放量(w/w)分别为81%和62%。在24小时后，两种生物复合材料的累积释放都达到了一个平台。

结果表明，由于PCL含量高，GCLPH具有较好的胶原和明胶包封率，而未包封的明胶或胶原在3天内释放，剩余的明胶或胶原将根据PCL降解速率缓慢释放。此外，在PCL含量较低的复合材料中，明胶用量显著增加了蛋白质的释放量，但对高PCL含量的聚合物没有影响。

图1 G/C/P生物复合材料在37℃下PBS中的累积蛋白释放

然后，他们做了SEM观察该生物复合材料的表面形貌特征，表面明显存在不规则的孔隙结构(20-100m)。PCL含量较低的生物复合材料(GCLPL)表现出更多的多孔结构。另一方面，胶原含量较高的生物复合材料(GCHPL和GCHPH)与胶原含量较低的生物复合材料(GCLPL和GCLPH)相比，表现出较少的孔结构。胶原含量最高、PCL含量最低的GCHPL生物复合材料由于底层胶原垫结构而表现出粗糙的纤维表面。与含量较高的PCL比，由于PCL相可以形成光滑的上覆区，因此表面更光滑。

此外，胶原比例较高的生物复合材料表面似乎有凝胶状材料填充孔隙。所有生物复合材料均表现出由光滑PCL相覆盖的G/C垫的粗糙、纤维结构，所观察到的形态差异很小。

图2 GCLPL, GCLPH,GCHPL, and GCHPH生物复合材料的SEM图

接下来，他们测试了PHEK（原代人表皮角质形成细胞）、PHDF（人真皮成纤维细胞）和ASCs（人脂肪源性干细胞）在G/C/P上的附着和增殖，在1天内，GCLPH和GCHPL上的PHEK数大于其他生物复合材料。在C/P生物复合材料上，PHEK的细胞密度（1：8）大于G/C/P生物复合材料的细胞密度(P<0.05)。

在9天内，PHEK在C/P和G/C/P生物复合材料上的细胞密度几乎相等(P>0.05)。基于这些结果，PHEK、PHDF和ASCs在所有G/C/P生物复合材料上均有良好的附着和增殖。并且他们也观察了PHEK和PHDF在该材料上的的形貌。在生物复合材料上观察到类似颗粒形状的角质形成细胞。随着孵育时间的延长，成熟角质形成细胞的结构蛋白细胞角蛋白-14的表达增加。

在GCLPH和GCHPL上播种的成纤维细胞和细胞角蛋白-14的α微管蛋白表达高于其他组三天。因此，选择4种G/C/P支架中胶原含量最低的GCLPH生物复合材料作为试验动物研究的皮肤替代物。

图3 在G/C/P和C/P生物复合材料上生长的(A)原代人表皮角质形成细胞(PHEK)和(B)原代人真皮成纤维细胞(PHDF)(C)人脂肪干细胞(ASCs)的附着和增殖。

图4 免疫组织化学法测定(A)在4种G/C/P生物复合材料上生长的PHEK在1、3天和(B)在4种生物复合材料上生长的PHDF，因为缺乏一次抗体的染色对照出现在第二组列中。CK-14是PHEK的特异性蛋白，而α微管蛋白是PHDF的特异性蛋白。(标尺：250m)。

最后，该团队进行了体内动物研究。与对照组相比，GCLPH生物复合材料覆盖的两组均观察到快速伤口闭合。在GCLPH生物复合材料覆盖的两组中，伤口大小从8天明显减小到12天，然后逐渐减小到21天。在16天内，两组的伤口愈合率几乎相同。然而，基于伤口面积的伤口愈合在第21天表现出统计学差异(P<0.05)。对于只覆盖GCLPH但不覆盖ASCs种子GCLPH的组，甚至可观察到不完全的伤口闭合。

该团队在较低的胶原含量的基础上，开发了一种更便宜的皮肤替代品，整合了天然和合成生物聚合物的优点，以促进皮肤细胞的生长。

图5伤口闭合的比较：GCLPH支架覆盖裸鼠和ASCs播种至21天的全厚度皮肤缺损的外观。