菠萝蜜果醋发酵菌种的选育及发酵特性

目前菠萝蜜种植业面临的最大问题是其易腐性导致的巨大损失。因此，开发菠萝蜜新产品，为栽培者创造更高的收益，具有十分重要的现实意义。菠萝蜜果实含有多种营养物质，其发酵产品也能很好的保存原有的风味和营养成分。

醋酸菌是可将乙醇氧化生成乙酸的一类细菌，也是世界酿醋工业的重要微生物。醋酸菌不仅广泛用于生产乙酸、葡萄糖酸、山梨酸以及合成必要的维生素如VC，还在生化反应糖类和乙醇氧化的研究中扮演重要角色。关于菠萝蜜果醋发酵醋酸菌的选育研究相对较少，缺乏可参考数据。目前菠萝蜜果醋的研究鲜见报道，同时缺乏菠萝蜜果醋发酵的专用醋酸菌。

广东海洋大学食品科技学院的何宇宁、黄和*和钟赛意等人 通过菠萝蜜自然发酵与菌种三级筛选、生理生化鉴定、16S rRNA基因序列分析，筛选出适合菠萝蜜果醋发酵的醋酸菌；再通过发酵特性实验，比较选育的菌株与商业菌株As1.41在高乙醇体积分数和高温条件下的产酸能力。最终选育出菠萝蜜发酵果醋专用醋酸菌，提高菠萝蜜果醋产酸量和品质，为菠萝蜜果醋发酵提供优良菌种。

1 醋酸菌筛选

1.1 一级筛选

结果显示，经过72 h培养后有14 株菌有较小透明圈，31 株菌周围都有明显透明圈（图1）。对这31 株菌进行革兰氏染色镜检，均为革兰氏阴性菌（图2）。

1.2 二级筛选

结果显示，一级筛选的31 株菌进行产酸定性实验中，只有15 株菌生成红褐色沉淀。

1.3 三级筛选

结果显示，二级筛选的活化醋酸菌经过5 d连续发酵，15 瓶发酵液由于醋酸菌的不同，呈现出不同的气味，有醋香味、菠萝蜜果香味、馊臭味等，从中筛选出5 株产醋香和菠萝蜜果香的醋酸菌用于后续实验。

2 生理生化实验

根据菌株的生理生化实验结果和《伯杰细菌鉴定手册》的描述，初步判断筛选出的5 株疑似醋酸菌Aa723、Aa747、Aa844、Aa847和Aa941均属于醋酸杆菌属。

3 16S rRNA鉴定

由图3可知，5 株醋酸杆菌的PCR扩增产物的片段大小约为1 500 bp，且条带清澈无弥散，说明PCR扩增成功，可进行下一步的16S rRNA基因片段测序。

由图4可知，5 株醋酸杆菌在系统发育树中属于4 个不同的种。通过bookstrap检验1 000 次支持该进化树分支可信度，综合各菌株的生理生化特征和形态学结果，可以确定5 株醋酸杆菌:Aa723和Aa941为巴氏醋酸杆菌（A. pasteurianus），Aa847为法布拉姆醋酸杆菌（A. fabarum），Aa747为热带醋酸杆菌（A. tropicalis），Aa844为醋化醋酸杆菌（A. aceti）。其中筛选出的A. fabarum、A. tropicalis、A. aceti均为首次在菠萝蜜果醋醋醪中分离得到。

4 醋酸菌发酵性能实验

4.1 生长曲线测定

由图5可知，Aa723、Aa847的对数生长期在6～60 h之间，其他菌株的对数生长期为6～48 h。Aa941的生长量最大，OD600 nm值达到1.31，其次分别是As1.41、Aa747、Aa844、Aa847和Aa723，说明Aa941在筛选出的5 株菌株中具有较强的适应能力，且与商业菌株As1.41具有相似的生长曲线。菌种在对数期内具有较强的活力和繁殖能力，同时对外界刺激的应激反应较为灵敏，因此，选择48 h为醋酸杆菌种子液培养时间。

4.2 温度对发酵性能的影响

结果显示，在25～37 ℃范围内，除Aa723外，其他5 株醋酸杆菌的生长量、产酸量和醇酸转换率随着温度先升高后下降。Aa723与Aa941、As1.41分别在25、31 ℃时具有最高的生长量和产酸量，Aa723、Aa747在28 ℃时有最高醇酸转换率。在25～31 ℃范围内，Aa847、Aa941和As1.41的醇酸转换率变化较小，Aa844的生长量和产酸量波动较小，相比较而言，Aa723和Aa747的在该温度范围内敏感性较强。Aa941在31、34、37 ℃时的产酸量均为各醋酸杆菌中最高，分别达到38.70、35.78、19.79 g/L；在37 ℃时，6 个菌株均能保持一定的产酸量，但只有Aa941和As1.41的OD600 nm值能达到0.650以上，且能维持较高的醇酸转换率，分别达到65.10%和63.10%。

4.3 乙醇体积分数对发酵性能的影响

结果显示，随着乙醇体积分数的上升，各醋酸杆菌的生长量基本呈现下降的趋势，产酸量和醇酸转换率呈先上升后下降趋势；各醋酸杆菌在乙醇体积分数为2%时OD 600 nm 值最大，均高于0.950；在乙醇体积分数为4%时产酸量最高，说明低体积分数的乙醇不利于醋酸杆菌的产酸代谢。当乙醇体积分数大于8%时，6 株菌的生长值、产酸量和醇酸转换率均受到不同程度的抑制，其中Aa844受到的抑制最为严重，OD600 nm值和产酸量分别低于0.400 g/L和10.00 g/L，只有Aa941和As1.41的生长虽受抑制，但依然保持着较高的产酸量和醇酸转换率。在6 株醋酸菌中，当乙醇体积分数为4%，Aa941的产酸量最大，达到36.50 g/L；乙醇体积分数为6%、8%时，Aa941的产酸量和醇酸转换率均大于其他5 株醋酸菌，分别为30.15 g/L、74.85%和25.11 g/L、74.10%。

结 论

本研究通过富集培养、生理生化实验验和16S rRNA分子生物学鉴定的方法，对自然发酵的菠萝蜜果醋醋醪中醋酸菌进行发酵特性研究。结果表明，从菠萝蜜果醋醋醪中分离鉴定出5 株醋酸杆菌，分别为Aa723和Aa941（A. pasteurianus）、Aa847（A. fabarum）、Aa747（A. tropicalis）以及Aa844（A. aceti），其中不同醋酸杆菌对温度和乙醇体积分数的耐受性具有显著性差异。菌株Aa941发酵性能最佳，31 ℃连续发酵96 h，在乙醇体积分数为4%时产酸量最大，达到38.70 g/L；乙醇体积分数为6%时，30 ℃发酵96 h醇酸转化率达到最高，为74.85%。Aa941在8%高乙醇体积分数条件下，30 ℃发酵96 h产酸量和醇酸转换率分别为25.11 g/L和74.10%；在37 ℃高温下生长良好，乙醇体积分数4%发酵96 h产酸量和醇酸转换率分别为19.79 g/L和65.10%，其耐乙醇和耐高温性能优于商业菌种As1.41。醋酸杆菌Aa941能将菠萝蜜果酒发酵成具有菠萝蜜特征香气的果醋，可作为菠萝蜜果醋发酵的菌种，进一步丰富了果醋发酵所需的菌种资源。

本文《菠萝蜜果醋发酵菌种的选育及发酵特性》来源于《食品科学》2020年41卷14期183-189页，作者：何宇宁，黄和，钟赛意，刘海，秦小明。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190604-034。点击下 阅读原文 即可查看文章相关信息。

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