控制桃果实采后病害拮抗酵母的筛选及其固体制剂的制备

　　桃甜美多汁、营养价值高，但在贮藏和运输过程中极易受到病原菌侵染而发生病害。由匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）引起的软腐病是桃果实采后主要病害之一，发病的果实会丧失可食用性，造成巨大的经济损失。因此必须采取有效的措施控制桃果实采后病害。近年来，利用拮抗微生物控制果蔬采后病害逐渐成为研究的热点，并有望成为替代化学杀菌剂的新方法。其中拮抗酵母因其自身诸多优点而受到广泛的关注。因此利用拮抗酵母控制桃果实采后病害具有广阔的应用前景。

　　虽然拮抗酵母液体制剂的制备相对简单，但其运输和保存较为困难，因此制备拮抗酵母的固体制剂对其应用尤为重要。喷雾干燥法是一种将溶液、乳液或悬浮液快速干燥成固态产品的方法，具有干燥速率快、时间短（一般为15～40 s）、工艺简单和可连续化生产等优点。

　　江苏大学食品与生物工程学院的张晓云、闫雪莉和张红印*等人从实验室分离保存的4 株酵母菌中筛选对桃果实采后软腐病具有控制作用的拮抗酵母菌，进一步考察拮抗酵母对桃果实自然腐烂的控制效果及其对桃果实品质的影响；然后通过单因素试验考察喷雾干燥过程中所用保护剂种类、阿拉伯胶和海藻糖比、保护剂质量浓度、雾化压强、进风温度和进料速率对固体制剂中拮抗酵母活菌数的影响，从而优化喷雾干燥的条件，并测定所制备的固体制剂在25 ℃和4 ℃保存过程中拮抗酵母的存活率以及保存90 d的固体制剂对桃果实采后软腐病的控制效果，为制备可用于控制桃果实采后病害的拮抗酵母制剂提供参考，对加快拮抗酵母的实际应用进程具有促进作用。

　　1 拮抗酵母的筛选

　　不同拮抗酵母对果蔬水果采后病害的控制效果不同。本实验中，将4 株酵母菌接种在白凤水蜜桃伤口处2 h后，再接种较高量R. stolonifer孢子悬浮液（30 μL，5×10 4 spores/mL），桃果实的腐烂率和腐烂直径如图1、2所示。

　　由图1可知，60 h后，P. occidentalis和D. hansenii处理的桃果实腐烂率与对照组（71.31%）没有显著性差异（P＞0.05），而P. anomala和P. membranaefaciens处理的桃果实腐烂率显著低于对照组，尤其是P. membranaefaciens处理的桃果实腐烂率仅为20.10%。72 h后，4 株酵母菌处理的桃果实腐烂率均显著低于对照组（95.70%），其中P. membranaefaciens处理的桃果实腐烂率仍然最低（26.23%）。

　　从图2可以看出，4 株酵母菌处理对桃果实腐烂直径的影响结果与腐烂率相似。因此，后续以菌株P. membranaefaciens作为研究对象，开展进一步的研究。

　　2 新鲜P. membranaefaciens悬浮液对桃果实采后自然腐烂及贮藏品质的影响

　　结果显示，在20 ℃条件下贮藏8 d，相比于对照组，酵母处理的桃果实自然腐烂率显著降低（P＜0.05），且品质相关指标（如质量损失率、硬度和可溶性固形物等）与对照组相比均无显著性差异（P＞0.05）。该结果表明，P. membranaefaciens能显著抑制采后桃果实的自然腐烂，并对桃果实的品质无显著不良影响。

　　3 P. membranaefaciens固体制剂的制备

　　3.1 保护剂的筛选

　　如图3所示，在第1组实验中，阿拉伯胶单独作为保护剂，制剂中P. membranaefaciens活菌数显著低于其与β-环糊精、麦芽糊精、海藻糖作为复合保护剂时的活菌数。其中阿拉伯胶与海藻糖作为复合保护剂时活菌数最高，为8.1（lg（CFU/g））。第2组和第3组实验结果与第1组类似，组内活菌数最高的保护剂分别是脱脂乳粉与海藻糖、酪蛋白酸钠与海藻糖。可见加入海藻糖作为保护剂对提高固体制剂中P. membranaefaciens活菌数具有显著作用。3 组实验中，阿拉伯胶与海藻糖作为复合保护剂时，制剂中酵母菌活菌数最高。因此，后续实验选择阿拉伯胶和海藻糖作为复合保护剂。

　　3.2 阿拉伯胶与海藻糖质量比对固体制剂酵母活菌数的影响

　　考察阿拉伯胶与海藻糖质量比对固体制剂中P. membranaefaciens活菌数的影响至关重要。由图4可知，随着海藻糖所占比例的增加，固体制剂活菌数先升高后降低，当阿拉伯胶与海藻糖质量比为1∶1时活菌数最高，为8.07（lg（CFU/g））。因此后续实验选择阿拉伯胶与海藻糖质量比为1∶1作为复合保护剂。

　　3.3 保护剂质量浓度对固体制剂酵母活菌数的影响

　　由图5可知，固体制剂中P. membranaefaciens活菌数随着保护剂质量浓度的增加而呈现先升高后降低的趋势，保护剂质量浓度为100 g/L时，活菌数最高。在喷雾干燥过程中，当保护剂质量浓度过低时，对酵母菌保护作用减弱，菌体暴露在高温下导致其死亡；而当保护剂质量浓度过高时，形成的颗粒直径增加，为了达到干燥目的，则需延长干燥时间，造成菌体暴露在高温下的时间延长，从而导致固体制剂中活菌数迅速降低。因此后续实验选择保护剂质量浓度为100 g/L。

　　3.4 雾化压强对固体制剂酵母活菌数的影响

　　如图6所示，随着雾化压强的增大，固体制剂中P. membranaefaciens活菌数先升高后降低，当雾化压强为200 kPa时，活菌数最高，为8.08（lg（CFU/g））。在喷雾干燥过程中，增大雾化压强可以减小液滴大小，提高雾化效果。但雾化压强过高时，菌体由喷嘴喷出时受到的剪切力增大，导致菌体损伤甚至死亡。因此后续实验选择雾化压强为200 kPa。

　　3.5 进风温度对固体制剂酵母活菌数的影响

　　结果显示，随着进风温度的升高，固体制剂中P. membranaefaciens活菌数呈上升趋势，在110 ℃达到最大值，但与100 ℃无显著性差异。继续升高进风温度至120 ℃，活菌数维持不变。在喷雾干燥过程中，随着进风温度的升高，酵母菌表面的水分蒸发加快，干燥时间缩短，单位质量制剂中酵母活菌数增加。当进风温度超过120 ℃后，制剂中活菌数迅速降低。综合考虑温度对酵母菌活性的影响和能耗等因素，最终选择100 ℃作为后续实验的进风温度。

　　3.6 进料速率对固体制剂酵母活菌数的影响

　　结果显示，随着进料速率的提高，活菌数呈现先上升后下降的趋势，当进料速率为15 mL/min时，固体制剂中P. membranaefaciens活菌数最高，为8.35（lg（CFU/g））。进料速率较低时，单位物料承受的热量增加，导致菌体因受热过多而出现部分死亡，在进料速率达到15 mL/min时，进料速率与其他影响因素的相互作用达到平衡，制剂中活菌数达到最大。随着进料速率的进一步增加，单位时间内雾化的小液滴增多，物料表面水分蒸发量减少，最终导致固体制剂中含水量增加，因而单位质量固体制剂中酵母活菌数降低。因此后续实验选择进料速率为15 mL/min。

　　4 固体制剂的水分含量及保存期间酵母菌的存活率

　　在单因素试验优化的条件下（阿拉伯胶与海藻糖质量比1∶1、壁材质量浓度100 g/L、雾化器压强200 kPa、进风温度100 ℃、进料速率15 mL/min）进行喷雾干燥，获得的固体制剂活菌数为2.25×10 8 CFU/g；水分质量分数为4.78%，达到GB 20287—2006《农用微生物菌剂标准》对农用微生物菌剂水分含量的要求。

　　从图9可以看出，固体制剂中P. membranaefaciens存活率均随着保存时间的延长而缓慢降低，保存90 d后，P. membranaefaciens的存活率分别为66.97%（25 ℃）和82.91%（4 ℃），表明该固体制剂于4 ℃保存效果明显优于25 ℃。

　　5 固体制剂对桃果实软腐病的控制作用

　　由图10可以看出，CK组（阴性对照）和阳性对照组的腐烂率无显著性差异（P＞0.05）。新鲜酵母、25 ℃和4 ℃保存90 d的固体制剂对桃果实软腐病均有显著的控制效果。4 ℃保存90 d的固体制剂的控制效果（发病率37.04%）与新鲜制备的酵母（腐烂率31.48%）虽有显著性差异（P＜0.05），但控制效果仍然非常明显。因此该固体制剂于4 ℃保存90 d后，仍然具有良好的防治效力，具备商业化开发和实际应用的价值。

　　结 论

　　本实验筛选到1 株对桃果实采后软腐病具有良好防治效力的拮抗酵母P. membranaefaciens。该拮抗酵母处理的桃果实贮藏72 h后，软腐病引起的腐烂率（26.23%）显著低于对照（95.70%），还可以显著降低桃果实采后自然腐烂率，且对桃果实品质无显著不良影响。因此，该拮抗酵母应用于桃果实采后病害的控制，可减少化学农药的使用，对保障食品安全和环境保护具有重要意义，具有良好的应用前景。

　　单因素试验优化的喷雾干燥法制备该拮抗酵母固体制剂的条件为:保护剂阿拉伯胶与海藻糖的质量比1∶1、保护剂质量浓度100 g/L、雾化器压强200 kPa、进风温度100 ℃、进料速率15 mL/min。制备的P. membranaefaciens固体制剂在25 ℃和4 ℃保藏90 d后，酵母存活率分别为66.97%和82.91%。4 ℃保存90 d的固体制剂处理的桃果实采后软腐病发病率（37.04%）与新鲜制备的拮抗酵母处理的桃果实发病率（31.48%）虽有显著性差异，但控制效果仍然非常明显。该拮抗酵母喷雾干燥固体制剂制备技术的建立，可加速拮抗酵母在桃果实采后病害控制中实际应用的进程，促进拮抗酵母生防制剂的产业化。

　　本文《控制桃果实采后病害拮抗酵母的筛选及其固体制剂的制备》来源于《食品科学》2020年41卷14期210-216页，作者：张晓云，闫雪莉，吴锋，顾香玉，赵利娜，张世涛，张红印。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190530-379。点击下 阅读原文 即可查看文章相关信息。