干货 | 在实验室里怎么骚操作才能得到完整纯净的 RNA？

完整、纯净的 RNA 是实验能继续顺利进行的重要保障，然而每每在实验室干活儿的时候，经常会听到一旁师弟师妹灵魂般的呐喊：

为啥我的 RNA 又不行了？？？

分子实验室难免会遇到 RNA 降解、污染甚至提不出来的情况，今天我们不妨来聊聊，在实验室里怎么骚操作才能得到完整纯净的 RNA。

先说说RNA：

核糖核酸（缩写为 RNA，即 Ribonucleic Acid），存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA 由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。单链的 RNA 分子不稳定，很容易被无孔不入的 RNA 酶降解。

现在知道了这一点，我们来对症下药。

我们实验室抽提 RNA 用的是某根公司生产的植物抽提 RNATRIzol 试剂盒，但是对着试剂盒无脑操作也不行，还是有一点点的规律可循的。

1. 实验材料准备和前处理。

RNA-free 的离心管、枪头、一次性手套、口罩等等硬件设备就不赘述了；新试剂瓶使用前酸浸泡过夜，冲洗干净，0.01% DEPC 水处理后高温灭菌；其他用具有条件的话一律紫外灭菌，双手戴手套前后喷酒精消毒。

植物材料以水稻举例。

如果不是特殊种子比如突变致死表型的，那么在温室里培养一下，让种子长成幼苗来提幼苗的 RNA 会比一般种子效果要好很多，毕竟活跃的细胞里面 RNA 含量比正在休眠的种子会稍微高一点，也有利于提取。

（PS：建议选择水稻生长周期为移植后 12-15 天的幼苗，经验表明此时提取 RNA 的效果相对比较好，每个离心管里面放上 3-5 片完整叶片，保证材料用量，太少也不行不是？拟南芥可以再多一些）

如果是突变体种子，不幸突变基因导致了致死表型，一点点小芽都发不出来的，从两个方面入手，一是浸种催芽，能让种子萌动一点就尽量萌动一点；二是加大种子用量，一个离心管里面多放几粒种子，稍稍富集一点也好，总比没有强，对吧。我自己的习惯是致死种子 10-12 粒左右，数量太多了后面也会有新的麻烦，比如过滤时堵塞过滤孔。

我自己提 RNA 一份的叶片，大概放这么多（Emmmm 其实是稍微有点多的）

粉碎打磨用的的钢珠有新的就用新的（刚买来没拆封的），最好实验室有一些专用的 RNA-free 的钢珠。坦白说，我虽然心里知道高温灭菌可能没有太显著的效果，不能使所有的 RNA 酶灭活，不过还是会在第一次把钢珠保存起来之前用 0.01% DEPC 水过一遍，然后高温高压灭菌，统一存放起来。专次专用。

2. 提取过程。

样品粉碎后加入裂解液，震荡取上清液，转移过滤。在过滤之前，因为粉碎的植物样品颗粒还是非常大，因此建议在转移之前，把离心管高速离心几分钟（我的做法是 12000 rpm，3-5 分钟），只小心地把上清液吸取转移即可，可以有效的避免过滤柱孔被堵住的问题。

酒精洗脱两次、Buffer RW1 洗脱后，DNAase I 混合液孵育。DNAase I 注意保存在 - 20℃的低温环境中，而不是和试剂盒一样放在常温里。混合液溶剂注意用 RNA-free Water 稀释。

Buffer RW1 和 Buffer RW2 溶液再次洗脱后，离心管不要立刻加入 RNA 洗脱液，现在离心机中空离 1-2 分钟，除净其他液体，然后加入 RNA 洗脱液。

一般试剂盒中提供的是 RNase-Free ddH2O，悬空滴入过滤柱的中央后，静置 1-2 分钟，离心得到 RNA 溶液。为了使它的浓度稍微大一点点，我会把得到的 RNA 溶液重新滴加在过滤柱的中央，再次静置、离心，这个步骤重复 1-2 次。

我自己在做实验的过程中，会拆一盒新的一次性塑料手套，每做一步换一双手套；口罩戴三层。

整个步骤全部在超净工作台中进行，就算求个心理安慰 / 手动狗头。

笔者的丑照（逃） 现在来看这个超净台的玻璃开得有点大了……

3. 保存方法。

如果试剂盒提供的 RNA-free Water 溶解 RNA，溶液要在 - 80℃冰箱里低温保存；如果是 75% 的乙醇溶液，在 - 20℃的环境里也可放置三个月到半年左右的时间。

后续用到 RNA 的实验应尽快进行，避免降解。

理论上讲 RNA 在超低温冰箱里保存时间应该比较长，但是经验来看，即使密封的很好，-20℃和 - 80℃冰箱大家每天都要拿样品、拿试剂，开开关关的，也难免污染得比较快，一星期左右就不好说有没有讲解了，所以 RNA 还是现用现提更合适。我个人习惯抽出半天把 RNA 提取搞定再进行后面的步骤，新鲜无污染的 RNA 用起来超爽啊。

我提的全都是水稻野生型的叶片，就没写序号，理论上还是写一下的好

4. 最后聊一聊 RNA 的纯度检测和浓度测定。

我们用的是 1% 琼脂糖胶对 RNA 的完整性进行检测 （上样量量最好要大于 200 ng） 。现提的 RNA 立刻点样跑胶的话，降解的不厉害一般影响不大。跑胶前给电泳槽换一下新的电泳缓冲液。如果提取的 RNA 完整，在胶面上应该可以看到 18S 和 28S 两条清晰完整的条带，28S rRNA 条带的强度应当大致为 18S rRNA 条带的两倍。如果两条条带缺失或非常弱，说明有可能是 RNA 出现了污染或降解。

渣图供大家吐槽 / 惭愧，最后那个孔竟然没跑出条带来……

RNA 的浓度用紫外分光光度计 （Nanodrop 我们实验室的品牌是 Thermo Fisher） 测定，理想情况下 A260/A280 = 1.8-2.0。

A260/A280 值小于 1.65 时，说明样品可能存在蛋白质、酚或多糖的污染。我们在第一步破碎裂解时，吸取上清液转移可能吸到了有机相，做这一步的时候除了注意小心吸取外，可以考虑适当减少植物样品的用量，增大离心力和延长离心时间，让裂解过程进行完全、充分。对最终得到的样品纯度要求比较高的话，可以重新用氯仿再抽提一次。除此之外，洗脱和溶解 RNA 时最好用试剂盒提供的 RNA-free Water 进行溶液，如果是自己实验室的去离子水，稀释过程也有可能导致结果偏低。

A260/A280 值大于 2.0 时，则可能是 DNA 污染或异硫氰酸没有除干净。DNA 污染看一下 DNAase I 是否失活，换用新的有良好的活性的 DNAase I 进行。

水稻叶片的话，老老实实按说明书进行，理想时提到的浓度 1000+ ng/ul 还是问题不大的。

归根结底，如果老板愿意给买昂贵的、进口的、更好用的试剂盒，何至于此啊？

分子实验一般是结果导向的，根据结果找原因，多数的原因应该大致就像这样了 。

要是你已经很小心很小心了，R NA 还是常常污染，我觉得就去可以庙里烧个香了，因为我进实验室门的时候，师兄对我说：

师妹呀，常心怀敬畏 ——实验室上方三尺有神明。

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