母系遗传病攻克有望！刘如谦团队首次实现线粒体精准基因编辑

近年来，基因治疗技术飞速发展，尤其是以CRISPR为代表的基因编辑技术的进步，让人类最终战胜遗传病带来无限希望。

线粒体（mitochondrion），是细胞的“能量工厂”，线粒体内有一套独立于细胞核的遗传物质——线粒体DNA（mtDNA），人类mtDNA的长度为16569bp，拥有37个基因，编码13种蛋白，这些蛋白都参与细胞的能量代谢。mtDNA突变会带来母系遗传Leigh综合征、线粒体肌病、Leber遗传性视神经病、共济失调舞蹈病、骨骼肌溶解症等几十种遗传疾病。据统计5000个成人中就至少有1个患线粒体遗传病。

然而，似乎无所不能的CRISPR基因编辑，面对线粒体遗传病却显得束手无策。

强大的CRISPR技术对线粒体基因组束手无策的原因主要有两点：线粒体基因组相对较小，人的mtDNA仅为16569bp，缺少足够的CRISPR可编辑位点。此外，CRISPR基因编辑必须依赖gRNA才能发挥作用，而目前并无有效方法将外源RNA高效导入线粒体内。

线粒体基因突变引发了一系列难以治愈甚至致死性严重疾病，因此，开发线粒体基因编辑工具一直是线粒体遗传学领域的长期目标。

面对这一难题，在基因编辑领域屡屡取得重大突破的刘如谦（David Liu）再次出手。

2020年7月8日，刘如谦团队在国际顶尖学术期刊 Nature 杂志发表了题为：A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing 的研究论文。

研究团队发现并命名了一种细菌毒素——DddA，它可以催化双链DNA（dsDNA）中胞苷的脱氨，将胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）。

将DddA分裂半体与转录激活子样效应子阵列蛋白（TALE）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂融合，产生无RNA的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE），可催化人mtDNA中CG到TA的转化，且具有很高的靶向特异性和编辑准确性。

这一不依赖CRISPR的碱基编辑器——DdCBE，能够实现对线粒体基因组（mtDNA）的精准编辑，这为研究线粒体遗传病和治疗线粒体遗传病带来了前所未有的工具。

这也是刘如谦继单碱基编辑（Base Editor）和先导编辑（Prime Editor）后，在基因编辑领域取得的又一重大突破。

哥伦比亚大学线粒体疾病研究专家Michio Hirano认为这是一个“非常聪明”的策略，堪称“问鼎了线粒体研究领域的圣杯”。

2018年，华盛顿大学Joseph Mougous教授实验室的博士后Marco de Moraes在实验中无意间发现了一种细菌毒素——DddA，该毒素可以在DNA双链上催化胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），这是前所未见的。

Joseph Mougous教授决定与开发了单碱基编辑技术的刘如谦团队合作，合作之处，两个团队便意识到DddA与单碱基编辑器（Base Editor）相比并无明显优势。这促使研究团队改变研究方向，随后，麻省总医院研究线粒体功能障碍专家Vamsi Mootha加入研究团队。

为了将细菌毒素——DddA应用到线粒体基因编辑中，还需要克服三大难题：

首先，DddA属于胞苷脱氨酶，它对哺乳动物细胞有毒，无法直接使用。为此，研究团队将DddA蛋白拆分为无活性的两半，称为split-DddAtox halves。

然后，将这一半的DddA与TALE蛋白融合，可以将TALE蛋白与特定的DNA序列结合。人工设计的TALE蛋白可与特定的DNA分子结合。当两个TALE与线粒体DNA（mtDNA）结合后，原本被拆成两半的DddA重新聚集在一起，恢复了催化碱基编辑的活性。

其次，想要将这一基因编辑工具递送到线粒体基质中，它们必须要穿过线粒体的双层膜。因此，研究团队使用线粒体靶向信号的氨基酸序列标记了构建的基因编辑工具。对于线粒体双层膜来说，这一基于蛋白的导入机制比基于RNA的导入系统（如CRISPR-Cas9）更具优势。

第三，DddA是将胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），大家都知道U是RNA特有碱基，虽然U跟DNA中的胸腺嘧啶（T）相对应，具有相同的碱基配对特性，但它毕竟属于RNA，当U出现在DNA上，很容易在尿嘧啶-DNA糖基化酶帮助下从DNA上切下。

因此，研究团队将TALE–DddA分裂半体与尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）融合在一起。这样可以保护U免受糖基化酶的干扰，直到下一轮DNA复制或修复发生为止，此时互补链的鸟嘌呤（G）（在编辑前与C配对）被腺嘌呤（A）取代， UGI的加入使编辑效率提高了大约八倍。

最终，研究团队构建了由线粒体靶向信号肽、TALE蛋白、DddA分裂半体及尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）组成的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE）。

实验证实了该编辑工具可以有效导入人细胞中的线粒体，并且可以精准编辑线粒体基因（mtDNA），催化人mtDNA中CG到TA的转化的编辑效率在5%—50%之间。编辑效率受多种因素影响：两个DdCBE亚基之间的间隔、TALE的设计、分开的DddA分裂半体的方向，以及靶点胞嘧啶相对于TALE结合位点的位置等。

此外，研究团队还验证了该线粒体基因编辑工具是否会脱靶导致对细胞核基因组的编辑，研究团队比较了使用了该编辑工具的细胞和未使用的细胞，发现没有在细胞核基因组中产生脱靶作用，因此，该编辑工具脱靶性很低。

早在2018年9月，Nature Medicine 杂志同期上线了两篇研究论文，来自剑桥大学和迈阿密大学米勒医学院的研究团队分别使用ZFN技术和TALEN技术实现了对小鼠线粒体突变基因的消除。

线粒体中的基因组编辑校正了体内致病性mtDNA突变

MitoTALEN降低突变体mtDNA载量并恢复异质mtDNA突变小鼠模型中的tRNAAla水平

但是，这两项研究均通过产生DNA双链断裂导致线粒体DNA降解，从而减少有害突变，然而，在高突变负荷下，这种方法可能会导致线粒体DNA拷贝降低至有害水平。

相比之下，刘如谦团队开发的线粒体碱基编辑工具——DdCBE，可以减少携带突变的线粒体DNA的比例，而不减少线粒体拷贝数。因此，当线粒体突变负荷很高时，DdCBE可能是首选，甚至是唯一的选择。

线粒体基因突变会带来母系遗传Leigh综合征、线粒体肌病、Leber遗传性视神经病、共济失调舞蹈病、骨骼肌溶解症等几十种遗传疾病，这些疾病无法治愈，且往往非常严重。此外，线粒体几乎全部由目前传递给子女，对于有线粒体遗传病的女性，想生出健康的孩子，只有通过线粒体移植的方式生出所谓的“三亲婴儿”。

据刘如谦团队统计，该线粒体编辑工具可以修复49%已知的线粒体有害基因突变。这一工具的发明，为线粒体遗传病的研究、治疗和预防，带来了前所未有的希望。

此外，线粒体作为细胞的“能量工厂”，线粒体基因组与人类衰老、癌症，以及其他复杂疾病有着密切关系，DdCBE的出现，也为相关研究带来了新的工具。