Mol Plant Pathol | 小麦抗白粉病基因Pm21-CC篇

植物胞内免疫受体NLR(Nucleotide-binding and Leucine-rich Repeat，NLR)能够直接或间接地识别病原菌分泌的效应子(effector)，迅速启动效应子诱发的免疫反应(ETI)，并引发病原菌侵染部位寄主细胞的死亡。前人研究已证实，激活的NLR具有诱导寄主细胞死亡的活性，而且NLR的活性改变与其结构关系密切。然而，由于NLR诱导的细胞死亡和抗病途径的很多组分没有鉴定出来，因此，这两种信号途径的关系还没有明确定论。以小麦抗白粉病基因Pm21为研究对象，江苏大学何华纲和河南大学李锁平团队合作对NLR与寄主细胞死亡的关系进行了探讨，取得了一些新的研究成果。

1、Pm21 eCC(extended CC)结构域能够充分引发细胞死亡，其活性受NBS和LRR结构域的负调控

通过构建Pm21不同结构域或组合结构域的瞬时表达载体(图1a)，利用农杆菌介导的方法在本生烟草中进行蛋白表达，采用台盼蓝染色法检测细胞死亡反应。结果表明，只有过表达eCC引起了本生烟细胞死亡，而其他结构域不能诱导本生烟细胞死亡。同时发现，含有CC结构域的CC-NBS和全长蛋白(CC-NBS-LRR)也不能诱导细胞死亡活性(图1b)。说明在没有病原菌诱导时，eCC是细胞死亡活性的功能结构域，且该活性受分子内其他结构域的负调控，而全长Pm21没有细胞死亡活性。通过免疫共沉淀(Co-IP)方法检测了不同结构域之间的互作情况，发现完整的eCC结构域可以自身互作，形成同源聚体，而截短的pCC(predicted CC)不能自我互作(图1c)，表明细胞死亡活性依赖CC结构域的多聚化。研究还发现，CC结构域可以与NBS和LRR结构域互作，而且，NBS也可以与LRR互作(图1d)。由此推测，在没有病原菌诱导时，这种分子内不同结构域互作抑制了CC结构域的细胞死亡活性，使Pm21全长蛋白维持失活状态。虽然目前还不能解释NBS与LRR互作的生化功能，但是根据拟南芥ZAR1的晶体结构来推测，NBS-LRR互作可能对Pm21蛋白的构型稳定具有一定作用。

图1 Pm21 CC结构域的细胞死亡活性受分子内其他结构域负调节

2、突变体功能分析揭示Pm21介导的细胞死亡信号与抗病信号相对独立

在之前的研究中，何华纲团队通过EMS诱变获得了大量Pm21感白粉病突变体，其中10个涉及CC结构域不同位点的突变。进一步研究检测了这些点突变对eCC结构域引发本生烟细胞死亡活性的影响。结果显示，突变E44K、C82Y和A117T导致eCC结构域丧失细胞死亡活性，而其他点突变并不影响死亡活性，表明E44、C82和A117位点对eCC结构域的细胞死亡活性具有重要作用(图2A)。为了进一步鉴定这些点突变对全长Pm21蛋白的影响，将10个单点突变分别引入到全长Pm21自激活突变体(D491V)中。本生烟瞬时表达结果显示，突变R73Q和E80K虽然不影响CC结构域的细胞死亡活性，但抑制了D491V调节的全长蛋白自激活(图2B)。一般认为，组成型的自激活代表了NLR蛋白在病原菌诱导后的激活状态，因此推测，R73和E80这两个位点可能通过参与全长蛋白分子内结构域的互作来调节Pm21的活性。值得关注的是，导致Pm21抗性功能丧失的某些突变并不影响Pm21的细胞死亡活性，暗示Pm21介导的细胞死亡信号途径和抗病信号途径可能是相对的独立过程。

图2 CC结构域的点突变对Pm21细胞死亡活性的影响

3、D491V调节的Pm21自主激活需要LRR结构域的参与

前人研究证实，NLR蛋白的保守基序MHD突变会导致蛋白自激活。为了分析Pm21蛋白中MHD基序对细胞死亡活性的效应，将Pm21蛋白MHD基序中491位氨基酸由D突变为V，构建了CC-NBS(D491V)和FL(D491V)瞬时表达载体。本生烟瞬时表达结果显示，FL(D491V)引起了强烈的细胞死亡反应，表明D491V突变导致Pm21蛋白的自激活(图3)。出乎意料的是，与FL(D491V)相比，CC-NBS(D491V)不能引起本生烟细胞死亡，该结果意味着D491V调节的Pm21自激活依赖于LRR结构域的参与。

图3 D491V调节的Pm21自激活活性检测

2020年5月18日，上述研究成果发表在植物病理学期刊《Molecular Plant Pathology》上，题目为“Pm21 CC domain activity modulated byintramolecular interactions is implicated in cell death and disease resistance”。河南大学高安礼副教授为论文第一作者，江苏大学何华纲副教授和河南大学李锁平教授为论文的共同通讯作者。该研究得到国家自然科学基金-河南省联合基金、江苏省农业科技自主创新资金等项目的资助。

主要参考文献

1. Gao A, Hu M, GongY, Dong R, Jiang Y et al. (2020) Pm21 CC domain activity modulated by　intramolecular interactions is implicated in cell death and disease resistance. Molecular Plant Pathology. DOI: 10.1111/mpp.12943.

2. He H, Zhu S, Zhao　R, Jiang Z, Ji Y et al. (2018) Pm21, encoding a typical CC-NBS-LRR protein, confers broad-spectrum resistance to wheat powdery mildew disease. Molecular Plant. 11: 879–882.

3. Wang J, Wang J, Hu M, Wu S, Qi J et al. (2019) Ligand-triggered allosteric ADP release primes a plant NLR complex. Science. 364: eaav5868.