华东师大田阳教授课题组JACS：单分子荧光寿命探针同时检测线粒体H2O2和ATP并实时成像

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导读

线粒体氧化应激和能量代谢是重要的生物学事件，参与细胞凋亡、坏死等多种生理和病理过程。然而，在这些过程中，线粒体H2O2和ATP的动态变化还不是很清楚，H2O2和ATP是否会相互影响彼此的变化。近日，华东师范大学田阳教授课题组在J. Am. Chem. Soc.上报道了单分子双光子荧光寿命探针（TFP）通过无光谱串扰的两个荧光通道同时检测线粒体H2O2和ATP，并实现实时成像，以揭示线粒体中H2O2和ATP的动态变化以及二者之间的关系。同时，首次发现O2和H2O2的外源性刺激对线粒体H2O2和ATP的水平表现出不同的影响。这项工作不仅为多物种成像提供了一种通用的分子设计方法，而且还基于这种策略开发的TFP探针发现了线粒体中氧化应激诱导的与H2O2和ATP相关的细胞内功能（DOI: 10.1021/jacs.0c00771）。

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图1.探针实时成像H2O2和ATP示意图（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

H2O2是一种稳定的活性氧分子（ROS），是维持线粒体氧化还原过程的主要成分，也是线粒体损伤的信使。同时，ATP是调节线粒体能量代谢的另一个重要信使。值得注意的是H2O2和ATP有着密切的关系。线粒体呼吸链产生能量的同时，还产生自由基，自由基迅速转化为H2O2。然而，更高的代谢率会导致产生更多H2O2，令人惊讶的是，ATP的不足也会导致线粒体膜电位的变化，从而导致H2O2的增加。另一方面，过量的H2O2可能损伤蛋白质或DNA，从而影响ATP的合成。因此，同时实时监控线粒体H2O2和ATP水平的动态变化是十分重要的。基于“打开”或“关闭”策略的荧光成像允许直接和非侵入性的分析，具有较高的空间和时间分辨率。然而，近年来报道的一些成像H2O2或ATP的荧光探针用于同时获取H2O2或ATP信号存在信号交叉、分布不均匀等问题。

在此，作者开发出利用不同荧光信号同时检测线粒体H2O2或ATP水平的单分子双光子荧光寿命探针（TFP）。该探针由三部分组成：线粒体靶向基团、H2O2激活基团和ATP激活基团。吡啶阳离子作为线粒体靶向基团，位于探针中部。由于线粒体膜电位为负，所以具有正电荷的探针可以聚集到线粒体。H2O2反应基团是萘二甲酰亚胺荧光体衍生物。H2O2可以与衍生物的苯硼酸频哪醇（Bb）反应，使得萘二甲酰亚胺恢复荧光。ATP反应基团是二亚乙基三胺修饰的罗丹明衍生物。该衍生物具有多个氨基，很容易捕获ATP。因为ATP的磷酸基团可以和氨基形成氢键，使得螺环内酰胺被打开，最终产生荧光。

图2. 探针设计及工作原理图（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

为了验证所开发的TFP探针可以通过构象变化选择性地响应H2O2，作者首先研究了TFP对H2O2的光学变化。H2O2的荧光通道激发波长为710 nm，发射波长为430-530 nm。在H2O2存在的情况下，紫外吸收发生蓝移，从401 nm蓝移到380 nm。荧光随着H2O2浓度的增加而增强。对平均荧光寿命的分析显示，探针为双光子发光。随后，作者又单独分析了TFP对ATP响应的光学性质。ATP的荧光通道激发波长也为710 nm，但其发射波长为550-650 nm。在ATP存在的情况下，562 nm出现新的紫外吸收峰，荧光随着ATP浓度增加而增强且呈线性关系，平均荧光寿命计算表明这也是一个双光子发光过程。最后，作者研究了在H2O2和ATP同时存在的情况下，TFP的发光情况。结果显示，随着浓度的增加，二者的双光子荧光强度和平均荧光寿命都逐渐提高。以上这些结果表明，TFP可以同时的无交叉检测H2O2和ATP。

鉴于TFP优秀的光学性质，作者研究了该探针用于同时检测神经细胞内H2O2和ATP，并且实现双光子寿命成像。荧光信号共定位分析显示，探针TFP很容易进入线粒体并且在线粒体内可以稳定存在2 h。成像结果显示，不同浓度的外源性H2O2存在下，H2O2和ATP荧光信号剧烈变化。通过计算发现，ATP水平降低。随后，作者用线粒体呼吸链抑制剂研究了能量系统对氧化还原的影响。结果表明，ATP急剧下降，但H2O2明显增加。这表明线粒体内ATP合成被阻断影响氧化还原平衡，从而影响H2O2水平。

图4. 共定位研究和双光子荧光寿命成像（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

受探针TFP的高选择性和准确性的鼓舞，作者尝试用该探针实时、定量的监测自由基O2–导致的线粒体H2O2和ATP的变化。实验结果表明，H2O2水平和ATP水平确实被O2–影响，探针TFP可以通过双通道成像捕捉到这些变化。

图5 实时成像，定量分析O2–对线粒体H2O2和ATP（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

为了检验TFP探针在体内的性能，作者进一步将TFP应用于活体斑马鱼幼体的成像。利用TFP，分别对正常氧和乏氧斑马鱼进行研究。成像结果显示，H2O2和ATP成像深度为50-400 μm，具有很强穿透性。缺氧斑马鱼的存活率较常氧斑马鱼明显下降。这表明斑马鱼在低氧条件下经历了氧化损伤和能量透支。

图6. 乏氧和正常氧条件下斑马鱼成像（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结：华东师范大学田阳教授课题组开发了一种双光子荧光寿命探探针，该探针可以实时成像并同时检测线粒体H2O2和ATP的变化而不发生信号串扰，因为TFP的荧光寿命在0.4-10 μM H2O2和0.5-15 mM ATP的检测范围内表现出良好的响应和选择性，具有荧光寿命成像的准确性和定量能力的优点，具有两种不同的发射光谱。利用该探针，田阳教授课题组研究了线粒体H2O2和ATP的动态变化及其关系，首次揭示了超氧阴离子对H2O2和ATP水平的影响，为多物种成像提共了一种通用设计方法。