黑曲霉作为分泌蛋白细胞工厂的研究进展

DOI：10.11949/0438-1157.20190591

引用此文献：姚善泾, 蔡礼年, 林东强. 黑曲霉作为分泌蛋白细胞工厂的研究进展[J]. 化工学报, 2019, 70(10): 3690-3703

黑曲霉作为分泌蛋白细胞工厂的研究进展

姚善泾，蔡礼年，林东强

(浙江大学教育部生物质化工重点实验室，化学工程与生物工程学院，浙江 杭州 310027)

摘 要

黑曲霉具有极强的分泌蛋白的能力，其分泌的木质纤维素降解酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等广泛应用于食品、饲料和生物技术等相关工业中。本文围绕黑曲霉生产同源和异源分泌蛋白，阐述黑曲霉作为分泌蛋白细胞工厂的巨大潜力。首先，通过总结黑曲霉表达系统的优越性，确定了黑曲霉作为分泌蛋白细胞工厂的开发前景。随后，介绍了初步构建黑曲霉分泌蛋白细胞工厂的一般流程。接着，总结了近十年来黑曲霉作为同源分泌酶细胞工厂的研究进展，提出在黑曲霉中定向表达分泌酶是深入研究黑曲霉自身分泌酶性质、功能和结构的理想策略。最后，总结了近年来黑曲霉作为异源分泌蛋白细胞工厂的研究进展，并从异源蛋白表达中遇到的难点出发介绍了完善黑曲霉细胞工厂来提高异源蛋白产量的对策。

引 言

细胞工厂是一个很有想象力的概念，把微小的活细胞与人们印象中规模化生产的工厂结合起来，其寓意在于让活细胞发挥一个工厂的功能，很具创意，也很有挑战性。目前，在很多现代生物技术研究和生物工程产业化中都自觉与不自觉地在使用细胞工厂的概念，但至今还没有一个完整的定义。目前一般认为能够成为细胞工厂的内涵和功能有：以细胞为基本单位，需要对细胞进行有目的的人工修饰和改造，通过细胞代谢的方式有目标地、批量地生产出预先设定的产品，包括能源物质、医药产品、生物产品、化学品等。构建一个成功的细胞工厂是一项非常复杂和精细的工作，涉及了很多方面，其中有三点特别重要：细胞的结构特点、细胞内的代谢调控以及细胞的表达和生产性能，或许这就构成了细胞工厂的三个要素。它们涉及了细胞类型对合成能力的影响、细胞代谢功能的调控机制、细胞生物合成能力的重构与优化等关键问题。因此，细胞工厂的开发需要对细胞类型进行有目的的选择，需要对野生型细胞进行改造，包括调控和修饰其细胞代谢途径，评估和改善其生物合成能力，也需要对细胞的培养方式进行优化，实现从无到有、从少到多、从分散到集中生产目标物质的目的。图1简单描述了细胞工厂的构建过程。目标物可以是初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、氨基酸、有机酸、核苷酸、维生素、脂肪酸等，也可以是次级代谢产物，如抗生素、激素、生物碱、蛋白等。通过基因工程、代谢工程、合成生物学等方法对支路途径中的相关基因进行调低或敲除，对干路途径中的相关基因进行增强或增加以提高目标物的产量。当然，由于细胞代谢网络的复杂性，对细胞途径的改造往往会牵一发而动全身，因此需要不断地尝试并优化。

图1 细胞工厂的构建

目前，大量的细胞工厂被相继开发，包括以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌为代表的细菌细胞工厂，以链霉菌为代表的放线菌细胞工厂，以酿酒酵母和毕赤酵母为代表的酵母细胞工厂，以曲霉、青霉和木霉为代表的丝状真菌细胞工厂，还有以动植物细胞为代表的高等细胞工厂等。不同种类细胞工厂的开发，极大地满足了人类日益增长的生产和生活的需求。一般来说，细胞本身的性能、培养和改造的成本决定了其细胞工厂的应用范围。大肠杆菌因其生长周期短、培养成本低、遗传背景清楚、遗传操作简单，已广泛应用于重组蛋白的表达和小分子化合物的合成。甲醇诱导表达系统的开发和高密度发酵的应用使毕赤酵母广泛应用于真核异源蛋白的表达。放线菌是抗生素的主要生产者，其改造和优化的目的往往是提高抗生素的产量。哺乳动物细胞具有完备的蛋白翻译后修饰功能，是理想的药用蛋白生产平台。丝状真菌培养成本低，分泌蛋白能力强，能分泌丰富的能够降解多糖、蛋白和脂肪的酶，广泛应用于酶制剂的生产。

欧洲酶产品制造商与配方师协会（Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme Products，AMFEP）已经进行了相关统计，如图2所示，结果显示2015年通过丝状真菌生产的商业酶有127种，占酶制剂总数的50%以上。在丝状真菌范围内，曲霉属、木霉属、青霉属是产酶的主力军，其中曲霉属产酶数量最多，占据了丝状真菌产酶总数的53%。在曲霉属范围内，黑曲霉是酶制剂的主要贡献者，约占曲霉属产酶总数的67%。由黑曲霉生产的45种酶制剂中包含了纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、蛋白酶、脂肪酶等，广泛应用于食品、饲料和生物技术等相关工业，黑曲霉作为分泌酶细胞工厂的巨大潜力可见一斑。

图2 商业酶生产菌株统计

数据来源于2015年AMFEP商业酶清单（https://amfep.org/about-enzymes/）；图中的数字和百分比分别代表菌株产酶的数量和占比

一般来说，野生型黑曲霉拥有完备的降解木质纤维素、淀粉、蛋白质、脂肪等大分子物质的酶系，通过诱变或者定向进化得到的在某一方面更加突出的菌株就可以用于工业生产。随着20世纪基因工程和遗传工程的兴起，人们对菌株的要求越来越高，通过对细胞内代谢途径的进一步认识和调控，再通过基因改造进一步提高其产酶效率，把菌株转变为理想的细胞工厂。本文将从构建黑曲霉分泌蛋白细胞工厂的意义出发，总结初步构建黑曲霉分泌蛋白细胞工厂的一般流程，展示其同源表达自身分泌酶和异源表达分泌蛋白中的研究进展，最后基于其异源表达过程中遇到的难点，提出进一步完善黑曲霉分泌蛋白细胞工厂的对策。

总结与展望

本文总结了黑曲霉作为细胞工厂在生产同源和异源分泌蛋白中的研究进展，并归纳了黑曲霉分泌蛋白细胞工厂的初步构建流程和完善策略。黑曲霉是分泌酶的宝库，深入研究黑曲霉自身分泌酶，对发现更多具有优良特性的酶，进一步促进工业酶的发展具有重要意义。黑曲霉异源表达分泌蛋白时产量往往较低，深入研究黑曲霉表达、加工和分泌蛋白的机理，从而对黑曲霉表达宿主进行遗传改造，是提高黑曲霉异源蛋白产量的重要保证。提高黑曲霉异源表达分泌蛋白产量的部分策略需要比单纯的过表达更高难度的遗传操作。这些操作包括基因的定点插入、相关基因的敲除或者敲低等。截至目前，基因敲除技术（转座子队列和同源重组）、基因编辑技术（Cre/Loxp、FLP/FRT和CRISPR/Cas）、基因敲低技术（RNAi）都已经被开发用于丝状真菌的遗传改造。代谢工程、合成生物学的发展为构建细胞工厂提供了更方便、更高效、更精准的手段和效果。随着研究的进行，相信对黑曲霉的遗传改造会越来越顺利，黑曲霉作为细胞工厂表达分泌蛋白定会取得新的突破。

1

构建黑曲霉分泌蛋白细胞工厂的意义

2

黑曲霉分泌蛋白细胞工厂的初步构建

图3 初步构建黑曲霉分泌蛋白细胞工厂的一般流程

表1 不同细胞表达系统的比较

3

黑曲霉细胞工厂生产分泌蛋白

3.1 同源蛋白的生产

表2 黑曲霉分泌酶

3.2 异源蛋白的生产

表3 黑曲霉异源表达的蛋白

4

黑曲霉分泌蛋白细胞工厂的完善

图4 黑曲霉蛋白分泌表达模式

4.1 提高转录效率

4.2 提高mRNA的稳定性

4.3 蛋白融合促进分泌

4.4 优化分泌途径

4.5 减少蛋白降解

我是文艺小破孩，感谢您的阅读！