近年来，中国农业大学杨淑华团队在植物低温应答调控研究方面取得了一系列重要进展 | 系统总结

低温严重阻碍植物正常的生长发育，限制植被的地理分布，并且影响农业生产。近年来，随着全球气候变化，极端气候频繁发生，低温寒害作为全球性自然灾害，对作物生长生存带来威胁，给农业生产造成巨大损失。因此，研究植物响应低温胁迫的分子机制具有重要的理论意义和生产实践价值。

中国农业大学杨淑华研究团队长期致力于植物低温胁迫信号通路的研究，近几年在该领域取得了一系列重要进展，相关研究成果发表在Molecular Cell, Developmental Cell, The Plant Cell, Molecular Plant, PNAS, The EMBO Journal, Trends in Plant Science等学术期刊上。我们对该团队的部分工作做了汇总，以期对从事相关研究的读者有所帮助。

2019年9月，杨淑华团队在国际学术期刊Developmental Cell在线发表了题为PUB25 and PUB26 promote plant freezing tolerance by degrading the cold signaling negative regulator MYB15的研究论文（中国农业大学直博生王西为该论文的第一作者，杨淑华教授为通讯作者）。该研究揭示拟南芥E3连接酶 PUB25/26通过调控CBF信号途径中的负调节转录因子MYB15的蛋白稳定性，从而参与植物对低温信号的响应过程。该研究发现了CBF信号途径中的新组分，进一步阐释了植物早期低温应答中CBFs基因被快速诱导的分子机制。

该研究通过对E3 T-DNA插入突变体库的筛选，发现U-box E3连接酶PUB25/26参与植物响应低温应答。双突变体pub25 pub26中，CBFs受冷诱导水平明显低于野生型，植株表现出冻敏感表型。进一步研究发现，PUB25/26与MYB15相互作用，并参与MYB15在低温处理早期的降解过程。同时，PUB25/26的T95/T94位点是蛋白激酶OST1的作用位点。低温激活OST1激酶活性，激活的OST1磷酸化PUB25/26，增强PUB25/26的E3连接酶活性，促进其对MYB15的蛋白泛素化降解，从而正调控CBFs低温下的诱导表达和植物的抗冻性。该研究揭示了PUB25/26介导的UPS参与调控植物抗冻性的分子机制，在OST1-PU25/26共同作用下，MYB15蛋白的内稳态得以平衡，最终实现对植物低温响应的精细调控。

图：低温激活的OST1激酶磷酸化PUB25/26，增强PUB25/26的E3活性，促进MYB15在低温下的降解；同时OST1磷酸化ICE1并增强其蛋白稳定性和转录活性，最终促进CBFs的表达，增强植物的抗冻能力。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.devcel.2019.08.008

2019年8月，杨淑华团队在The Plant Cell发表了题为BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE2 Negatively Regulates the Stability of Transcription Factor ICE1 in Response to Cold Stress in Arabidopsis的研究论文（已毕业直博生叶柯邑、李辉为共同第一作者，杨淑华教授为通讯作者）。该研究报道了蛋白磷酸酶BIN2 (BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE2) 能通过影响转录因子ICE1的蛋白稳定性调控冷锻炼关键基因CBF的表达，为阐明植物冷锻炼过程中基因精细调控机制提供了新的信息。

该研究通过酵母文库筛选，发现BIN2蛋白与CBFs基因上游转录因子ICE1互作，并通过一系列实验确证了这一互作。进一步研究发现作为蛋白激酶，BIN2能够磷酸化ICE1，促进后者的降解，最终降低了CBFs基因的表达。BIN2能够通过负调控转录因子BZR1和CESTA，降低CBFs基因表达 ，表明BIN2是CBFs基因的关键负调控因子。进一步研究发现，BIN2的激酶活性在植物受冷胁迫早期会显著降低，而在后期回复到胁迫前的水平。这表明植物在感受到冷信号后，会通过某种机制抑制BIN2的作用，释放多个转录因子诱导CBF基因表达，从而增强植物的耐低温能力；而在后期，BIN2的激酶活性恢复，防止过度响应对植物自身造成伤害。这项研究证明BIN2是植物冷响应过程的一个重要开关，对揭示植物应答低温胁迫的分子机制有重要意义。

2018年11月，杨淑华团队在The EMBO Journal在线发表了题为EGR2 phosphatase regulates OST1 kinase activity and freezing tolerance in Arabidopsis的研究论文（丁杨林博士为第一作者，杨淑华教授为通讯作者）。该研究报道了蛋白磷酸酶EGR2 (clade-E growth-regulating 2) 是调控OST1低温激活的关键组分，为阐明植物感受和应答低温信号的机制提供了重要的理论依据和可能的研究方向。

该研究鉴定到PP2C型E家族蛋白磷酸酶家族EGR2参与调控OST1低温激活过程。在正常温度下，EGR2与N-肉豆蔻酰基转移酶NMT1互作而被豆蔻酰化修饰，并且该修饰是其发挥低温应答调控功能所必需。豆蔻酰化修饰的EGR2（m-EGR2）与OST1互作，从而抑制OST1的激酶活性，这时有利于植物的正常生长。当植物遭受低温胁迫后，EGR2与NMT1的互作减弱，使得植物合成大量新的非豆蔻酰化修饰的EGR2（u-EGR2）。u-EGR2与OST1的互作减弱，从而解除对OST1的抑制；同时，在低温条件下，新合成的u-EGR2干扰m-EGR2与OST1的互作。以上双重因素使得OST1被低温激活，从而磷酸化下游组分ICE1和BTF3，增强植物的抗冻能力（图1）。该研究不仅揭示了OST1低温激活的分子机理，还暗示着豆蔻酰开关可能参与了植物对低温信号的感知与转导。

论文链接： https://doi.org/10.15252/embj.201899819

2018年3月，杨淑华团队在The EMBO Journal在线发表了题为OST1-mediated BTF3L phosphorylation positively regulates CBFs during plant cold responses的研究论文（丁杨林博士为第一作者，杨淑华为通讯作者）。该研究发现新生多肽链偶联蛋白复合体β亚基BTF3L (Basic Transcription Factor 3 Like) 正调控植物低温应答。该研究揭示了OST1-BTF3L蛋白复合体调控植物响应低温胁迫的分子机制，加深了我们对植物低温应答调控机制的理解。

先前研究表明，蛋白激酶OST1被低温激活后，磷酸化低温信号重要的转录因子ICE1，抑制ICE1的泛素化降解，从而增强植物的抗冻能力 (Developmental Cell, 2015)。为了进一步研究OST1调控植物低温应答的分子机制，杨淑华团队通过蛋白质谱方法结合酵母双杂交、体外Pull-down实验，双分子荧光标记 (BiFC) 和免疫共沉淀鉴定 (co-IP) 等实验证明BTF3和BTF3L是OST1的互作蛋白。进一步研究表明，在低温条件下，BTF3L能够被激活的OST1蛋白磷酸化，从而增强其与CBFs蛋白的相互作用。结果导致CBF蛋白稳定性增强，下游低温应答基因COR高量表达，植物的抗冻能力增强。此外，BTF3L蛋白通过间接调控CBFs基因的表达增强植物的抗冻能力。该研究发现并阐明低温应答新组分BTF3L调控植物低温应答的分子机制，同时也揭示了OST1在植物响应低温胁迫中新的调控机制。

2018年，杨淑华团队受邀在Trends in Plant Science发表了题为Molecular regulation of CBF signaling in cold acclimation的综述论文（施怡婷和丁杨林为共同第一作者，杨淑华教授为通讯作者）。该文从低温对植物的不利影响、低温锻炼概述、低温锻炼的转录调控、低温信号的感受、低温信号中的翻译后修饰、植物生长与耐低温之间的平衡等方面进行了全面的总结与归纳，并提出低温研究领域未来的研究方向。

2017年10月，杨淑华团队在Developmental Cell发表了题为MPK3- and MPK6-mediated ICE1 phosphorylation negatively regulates ICE1 stability and freezing tolerance in Arabidopsis的研究论文（已毕业直博生李辉为第一作者，杨淑华教授为通讯作者）。该研究发现丝裂原活化蛋白激酶MPK3和MPK6通过磷酸化CBF低温信号途径中重要的转录因子ICE1，抑制其蛋白稳定性和转录活性，负调控植物低温应答，揭示了蛋白激酶MPK3/6精细调控植物低温信号通路的分子机理。

该研究通过酵母双杂交技术筛选ICE1的互作蛋白，发现蛋白激酶MPK3和MPK6能够与ICE1发生相互作用。遗传证据表明，MPK3/6基因突变导致植物抗冻能力提高，MPK3/6位于ICE1的上游。研究人员发现低温激活MPK3/6的激酶活性，激活状态的MPK3/6通过磷酸化ICE1蛋白，抑制其在低温下的稳定性和转录活性，从而抑制CBF基因的表达。以上证据表明MPK3/6通过磷酸化ICE1负调控拟南芥对低温的耐受能力。该研究揭示了MPK3/6蛋白激酶在低温应答中的分子机制，其介导的负调控途径精细地调控植物冷响应的强度，能够使植物更好地协调逆境应答和生长发育之间的平衡。

图1. MPK3/6激酶活性被低温激活，磷酸化ICE1蛋白，促进ICE1蛋白在低温下的降解，从而抑制CBFs的表达，负调控植物对低温的耐受能力。

论文链接：

www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1534580717307840

2017年7月，杨淑华团队在PNAS发表了标题为PIF3 is a negative regulator of the CBF pathway and freezing tolerance in Arabidopsis的研究论文（博士研究生姜博晨和施怡婷副教授为共同第一作者，杨淑华教授为通讯作者，李继刚教授为共同通讯作者）。该研究发现光信号转导通路关键转录因子PIF3参与负调控植物抗冻性，同时E3泛素化连接酶EBF1/EBF2参与了低温介导的PIF3蛋白稳定性调控，揭示了光信号参与负调控植物抗冻性的分子机理。

该团队在筛选植物抗冻突变体的过程中，鉴定到光信号关键转录因子PIF3负调控植物抗冻性。pif3突变体表现出抗冻表型，而PIF3过表达转基因植株则具有明显的冻敏感表型。进一步研究发现，PIF3能够直接结合在转录因子基因CBFs的启动子区，抑制CBFs及其下游冷响应基因表达。此外，该研究还发现低温可以增强PIF3蛋白的稳定性。此前的研究表明，在常温光照条件下PIF3蛋白会被LRBs E3连接酶识别并降解。该研究发现了两个新的E3泛素连接酶EBF1和EBF2能够与PIF3发生相互作用，并使其通过26S蛋白酶体途径降解。低温及黑暗条件可以促进EBFs蛋白降解，从而使PIF3蛋白更加稳定。遗传证据进一步表明，EBF1和EBF2是植物冷响应途径的正调控因子，ebf1和ebf2单突变体在冷驯化前后均表现出冻敏感表型，而pif3突变体可以回复ebf1突变体表型。该研究通过揭示PIF3在低温响应过程中的新功能和调控机制，阐明了光和温度在植物冷驯化过程的关系密不可分，共同平衡着植物的抗冻性和生长发育过程。

图1. 在低温和黑暗条件下，泛素连接酶EBF1/EBF2发生降解，使PIF3蛋白积累并抑制CBF基因的表达

2017年3月，杨淑华团队在Molecular Cell上在线发表了标题为Plasma Membrane CRPK1-Mediated Phosphorylation of 14-3-3 Proteins Induces Their Nuclear Translocation to Fine-Tune CBF Signaling during Cold Response的研究论文（直博生刘子妍为第一作者，杨淑华教授为通讯作者）。该研究发现了一个新的低温负调控因子CRPK1 (cold-responsive protein kinase1)，揭示了低温信号从细胞膜传递至细胞核中的负调控机制和CBF蛋白翻译后修饰的调控机理。

该研究通过突变体筛选，发现了一个新的类受体激酶CRPK1负调控植物抗冻性。低温激活CRPK1活性，激活状态的CRPK1磷酸化14-3-3蛋白，磷酸化的14-3-3蛋白从细胞质进入细胞核后与转录因子CBF1/3蛋白相互作用并促使其降解。研究人员对CRPK1和14-3-3κλ基因突变体分析表明其抗冻性得到提高，相反，14-3-3λ过表达的植株株抗冻性降低。进一步研究表明CRPK1对于14-3-3蛋白入核和发挥功能至关重要。该研究结果证明CRPK1-14-3-3蛋白模块能将低温信号从细胞膜传导至细胞核，通过调节CBF蛋白稳定性调控植物的抗冻性。CRPK1介导的负调控途径精细地调控植物冷响应的强度，避免过度冷响应造成的生长抑制，从而使植物更好地平衡生长发育和抵抗逆境间的关系。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.02.016

2017年，杨淑华团队在Molecular Plant在线发表了题为BZR1 Positively Regulates Freezing Tolerance via CBF-Dependent and CBF-Independent Pathways in Arabidopsis的研究论文。该研究发现油菜素内酯BR途径中重要的GSK3家族激酶通过磷酸化其下游的BZR1转录因子负调控植物的耐冷性，而转录因子BZR1通过直接调控CBF1/2或COR基因的表达来引发植物对冷胁迫的反应。

论文链接： http://dx.doi.org/10.1016/j.molp.2017.01.004

2015年，杨淑华团队在Developmental Cell在线发表了题为OST1 kinase modulates freezing tolerance by enhancing ICE1 stability in Arabidopsis的研究论文。该研究发现，蛋白激酶OST1被低温激活后，磷酸化低温信号重要的转录因子ICE1，抑制ICE1的泛素化降解，从而增强植物的抗冻能力 。

杨淑华 博士，中国农业大学教授，长江学者特聘教授。1991、1994年先后在南开大学获得学士和硕士学位；2002年获新加坡国立大学博士学位。2002－2004年在美国康奈尔大学从事博士后研究。2005年受聘为中国农业大学教授。2012年获得“国家杰出青年科学基金资助，2014年被聘为教育部“长江学者”特聘教授，2018年获北京市“三八红旗奖章”称号。主要研究方向是植物响应低温胁迫的分子机制。兼任New Phytol、J Plant Physiol、J Genet Genomics编委、Faculty Member of F1000、Plant Cell Physiol顾问编委、《植物学报》副主编。

注：本文部分信息来源于植物生理学与生物化学国家重点实验室，中国农业大学生物学院。