专家点评Nature | 维生素C参与真核生物的DNA修饰，介导光合作用的反馈调控

点评 | 何川（HHMI、芝加哥大学）

责编 | 兮

DNA的化学修饰对基因表达具有重要的调控作用。目前已经发现的DNA修饰主要有5mC，6mA，5hmC，5fC，5caC，5hmU和base J（下图）。5-甲基胞嘧啶 (5mC) 作为其中最重要的表观遗传修饰碱基，广泛存在于多种生物的基因组中。近年研究发现，TET双加氧酶 (Ten-Eleven Translocation dioxygenases) 可以对胞嘧啶的5位甲基进行逐步氧化，依次生成5-羟甲基胞嘧啶 (5hmC), 5-醛基胞嘧啶 (5fC) 以及5-羧基胞嘧啶 (5caC)（下图）。后两者可以被TDG糖苷酶识别，通过碱基切除修复 (Base Excision Repair) 途径，完成DNA去甲基化过程【1-3】。

除了哺乳动物，其他很多生物中也存在TET双加氧酶的同源蛋白，包括一些单细胞真核生物，比如莱茵衣藻。但我们对这些TET同源蛋白的认识还几乎是一片空白。解析其他生物中TET的酶活性与功能，可以帮助我们理解TET在进化过程中的保守性，并有助于深入解析DNA的去甲基化究竟怎么发生。

2019年5月2日，Nature期刊在线发表了由我国科研人员徐国良、唐惠儒与黄开耀共同指导、中科院与复旦大学等多个单位协作完成的题为A vitamin C-derived DNA modification catalysed by an algal TET homologue的研究成果。该工作发现，在研究光合作用和纤毛的真核单细胞模式生物 — 莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中，TET同源蛋白可以将维生素C的半个分子的碳基骨架转移到DNA上，从而产生一种全新的DNA表观修饰。

研究者们首先在衣藻中找到了8个TET同源蛋白。对其中的CrTET1进行酶活分析后，发现这一蛋白具有不同于哺乳动物TET的5mC催化活性，并将其命名为CMD1 (5-methylcytosine modification enzyme 1)。进一步研究表明，CMD1可催化5mC产生两种新的DNA修饰核苷，分别被命名为P1, P2。通过质谱与核磁共振实验，研究者解析了他们各自的化学结构。P1和P2互为立体异构体，它们在5mC的甲基碳上衍生了一个甘油基, 因此研究者们将这个新的DNA修饰核苷命名为5-glyceryl-methylcytosine (5gmC)。这也是在自然界中发现的第12种DNA碱基（第8种DNA修饰碱基）。

在研究5gmC新增的甘油基的来源时，研究者惊喜地发现，传统双加氧酶反应中所必需的α-酮戊二酸 (2-oxoglutarate, 2-OG) 【4】存在与否对CMD1的酶活并无任何影响，这表明CMD1在反应机理上与TET有所不同。维生素C (Vitamin C, VC) 替代了2-OG参与CMD1的酶活反应。更令人惊讶的是，VC的C4-C6碳基骨架的部分被转移到5mC上，在5mC基础上形成了5gmC，这表明小分子代谢物对表观遗传学的影响可能远远超出目前的理解范围。在此基础上研究者们进一步解析了CMD1酶活反应的机理，发现CO2与乙醛酸为VC的反应副产物。

研究者们还进一步阐述了CMD1酶以及5gmC修饰的生理功能。他们首先在衣藻中开发完善了高效的CRISPR/Cas9基因编辑方法，获得了CMD1突变以及VTC2突变（VC合成过程的一个关键基因）藻株。在分别敲除两种基因的藻株中，5gmC含量都明显降低，而5mC含量则明显增加。进一步观察发现，cmd1突变藻株对强光的适应能力明显降低，RNA-Seq结果发现衣藻中与适应强光有直接关系的LHCSR3基因显著下调，同时发现LHCSR3.1基因的甲基化水平升高，这可能是导致其表达下调的一个原因。这也提示在某些特定区域内，CMD1可能参与了DNA去甲基化。研究者认为，除了与光合作用的调控有关以外，CMD1产生的DNA新修饰5gmC可能还有未知的生理功能有待探索。

总的来说，这项工作揭示了衣藻中存在一种由TET同源蛋白CMD1产生的全新的核酸修饰，使DNA双链形成四个碳原子相连的分叉，同时这种修饰介导光合作用的反馈调控。这项工作中CMD1催化的生化反应、维生素C的新功能以及甲基化DNA之上的进一步修饰都是令人惊喜的发现，它们极大地拓展了DNA结构与功能的内涵，加深了人们对生物适应环境机制的认识。

徐国良团队在DNA氧化去甲基化领域探索十余年，发现了动物TET酶催化产生5caC而参与DNA主动去甲基化（Science, 2011）; 揭示了TET酶在哺乳动物胚胎发育中的作用（Nature, 2011; Nature, 2016）（详见：徐国良院士在《Nature》发表文章阐明TET家族蛋白在胚胎发育中的重要作用）。

据悉，除上述三个课题组以外，中科院生化与细胞研究所丁建平、陈洛南，中科院有机所刘文、朱正江，上海师范大学马为民，中科院营养所尹慧勇，RWTH Aachen University的Elmar Weinhold，University of Pennsylvania的Rahul M. Kohli等实验室也参与了最近发表的研究。徐国良课题组薛剑煌博士、陈国栋博士、陈辉，以及唐惠儒课题组豪富华博士为本文共同第一作者。

专家点评

何川（HHMI研究员、芝加哥大学化学系终身教授 、John T. Wilson Distinguished Service讲席教授）

自然界的RNA上有150种以上的化学修饰。 而生物体的DNA上化学修饰种类要少很多。除去各种DNA损伤， 有调控功能的DNA修饰就更少了。 目前知道的不到十个（5mC，5hmC，5fC，5caC，6mA，5hmU，base J）。很多细菌的DNA有高丰度的6mA来调控各种机制。而很多真核生物的DNA有5mC来抑制基因表达。2009年美国的两个课题组在科学杂志（Science 2009a，2009b）上报道了一个paradigm-shifting的发现。他们在哺乳动物DNA上发现了有相对于DNA损伤更高丰度的5-hydroxymethylcytosine (5hmC)。Anjana Rao 实验室进一步发现哺乳动物的TET酶催化了DNA上从5mC到5hmC的转化。2011年徐国良实验室和张毅实验室发现TET可以催化DNA从5mC到5hmC，再到5-formylcytosine (5fC)和5-carboxylcytosine (5caC)的转化 (Science 2011a，2011b）。徐国良实验室发现DNA损伤修复酶TDG识别5caC， 通过DNA修复转化5caC回到没有修饰的C, 第一次揭示了一个DNA主动去甲基化的过程和机理。

TET在哺乳动物里的功能已经有了较多的研究。TET2和DNMT3A的突变都可以导致白血病。TET敲除导致全基因组的低甲基化而不是预期的过甲基化。TET不是哺乳动物专有的。 在低等真核生物里也存在。TET除了催化DNA上5mC的氧化也可以催化RNA上m5C的氧化。在绿藻的基因组里有八个TET同系蛋白。徐国良和合作者通过生物化学实验发现CrTET1（作者重新命名为CMD1）可以催化DNA上的5mC形成两种全新的产物。通常含单铁的双加氧酶用αKG做为辐助分子，用活性中心的铁激活氧气产生高价的铁氧化物来氧化甲基。 氧气活化需要四个电子。αKG的主要功能是提供两个电子。另两个由铁离子提供。作者发现CrTET1不用αKG做为辅助分子而用维生素C。维C不但提供氧气活化的两个电子还参于了5mC的氧化修饰。维C的一段甘油部分在氧化后接到了氧化产物上产生了两个新的5mC衍生物5gmC。当CMD1被敲除之后，在正常生长条件下对衣藻的生长并没有明显影响。但是在强光环境下，由于5gmC修饰的降低，可能导致5mC去甲基化过程受阻，可以上调一些基因的表达以对绿藻有保护作用。

这个工作有几个亮点。首先作者找到了两个互为stereoisomer（立体异构体）的新的DNA修饰， 并证实这两个修饰可以调空基因表达。作者找到了TET在单细胞真核生物里的DNA甲基化修饰功能。揭示了TET的DNA甲基修饰可能是进化里相对保守的功能。我个人觉的很有意义的发现是维C可以替代αKG做为辐助分子激活氧气。 这是生物化学上很有意义的发现。含单铁用αKG激活氧气的酶是一个很大的家族。去甲基酶只是其中一部分。很有可能其他含单铁的氧化酶也有一部分可能用维C做为辐助分子提供氧气活化所需的电子， 而维C并不一定需要成为产物的一部分。这个可能性以前在生物化学上被忽视了。科研水平和层次有高下之分。区别在哪呢？做科研的第一目标是 discover new knowledge，这篇文章做到了。

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1160-0

制版人：半夏

参考文献

1. Tahiliani, M. et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science 324, 930-935, (2009).

2. He, Y. F. et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science 333, 1303-1307, (2011).

3. Ito, S. et al. Tet Proteins Can Convert 5-Methylcytosine to 5-Formylcytosine and 5-Carboxylcytosine. Science 333, 1300-1303, (2011).

4. Hausinger, R. P. FeII/alpha-ketoglutarate-dependent hydroxylases and related enzymes. Critical reviews in biochemistry and molecular biology 39, 21-68, (2004).

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